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生殖健康及遗传病
遗传病
1. 背景介绍和临床意义
目前，遗传病已成为人类健康的重大危害之一，越来越为人们所关注。遗传病可分为单基因病和多基因病，其中单基因病是遗传病中很重要的一个类型。单基因遗传病是由一对同源染色体上单个基因或一对等位基因发生突变所引起。目前已知的很多遗传病都属于单基因病，如血友症、耳聋、色盲、多指、并指、苯丙酮尿症、佝偻病等等。一些多基因病也存在较清晰的易感基因，如糖尿病、心血管疾病和癌症等等。遗传病一般困扰终生、难以治疗，有些即使可以治疗，费用也十分昂贵。因此，遗传疾病的检测，不仅对于个体遗传疾病风险的检测有重要意义，而且对于避免影响后代也具有重要意义。对于很多未知的疑难杂症也可以通过遗传病的检查发现其疾病的基因层面根源，进而开发个性化的治疗方案。这也是精准医疗的一个终极目标。
2. 目前市面的检测手段
目前，有多钟遗传病检测手段，例如Southern，定量PCR，一代测序，STR分型，连锁分析、芯片分析和二代测序等。
其中，以针对少量位点的一代测序和定量PCR等方法使用最广泛，但此类方法通量低，存在突变位点遗漏可能，因而仅适用于已知明确位点的检测，不适合多点检测和未知潜在疾病的发现。随着技术的不断发展，芯片技术和高通量测序技术可以解决传统方法无法解决的检测位点少和检测通量不足的问题，可以一次性的实现几百种遗传疾病位点的检测。
3. Thermo Fisher提供的遗传病检测完整解决方案
3.1 遗传病检测高通量测序解决方案
Ion AmpliSeq遗传病研究试剂盒和Ion Torrent高通量测序系统组合
目前，Thermo Fisher公司已经推出了25个基于开创性Ion AmpliSeq超高多重PCR技术的相关遗传病商业化研究试剂盒以及人类全外显子组检测试剂盒（表4-1），可用于人类遗传疾病的高通量检测和研究,，包括遗传性肿瘤的易感研究。这些试剂盒适用Ion Torrent所有高通量检测平台，每个试剂盒的基因列表信息详见www.
Ampliseq.com。
表4-1. Ion Torrent高通量平台商业化遗传病检测方案汇总
| Ion AmpliSeq Cardiovascular Research Panel (心血管疾病研究试剂盒) (404 genes, 2 tubes, 10,430 amplicons) | Ion AmpliSeq Cardiac Arrhythmias and Cardiomyopathy Research Panel (心律不整及心肌症研究 试剂盒) (92 genes, 2 tubes, 2,198 amplicons） | Ion AmpliSeq Gastrointestinal Research Panel v2 (胃肠疾病研究试剂盒, v2) (194 genes, 2 tubes, 4,103 amplicons) | Ion AmpliSeq Renal Research Panel (肾脏疾病研究试剂盒v2) (154 genes, 2 tubes, 4,332 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Pulmonary Research Panel v2 (肺部疾病研究试剂盒v2) (131 genes, 2 tubes, 3,351amplicons) | Ion AmpliSeq Dermatology Research Panel v2 (皮肤病研究试剂盒v2) (222 genes, 2 tubes, 4,964 amplicons) | on AmpliSeq Endocrine Research Panel v2 (内分泌疾病研究试剂盒, v2) (340 genes, 2 tubes, 6,348 amplicons) | Ion AmpliSeq Inborn Errors of Metabolism Research Panel v2 (先天性代谢异常研究试剂盒, v2) (594 genes, 2 tubes, 9,681amplicons) |
| Ion AmpliSeq Primary Immune Deficiency Research Panel v2 (原发性免疫缺陷研究试剂盒 v2) (264 genes, 2 tubes, 5,241 amplicons) | Ion AmpliSeq Ophthalmic Research Panel (眼科疾病研究试剂盒) (316 genes, 2 tubes) | Ion AmpliSeq Hearing Loss Research Panel v1 (听力缺失研究试剂盒 v1) (63 genes, 2 tubes, 2,064 amplicons) | Ion AmpliSeq Deafness Research Panel v2 (耳聋研究试剂盒, v2) (122 genes, 2 tubes, 3,520 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Dementia Research Gene Panel (痴呆基因研究试剂盒) (17 genes, 2 tubes, 214 amplicons) | Ion AmpliSeq Autism Research Panel (孤独症研究试剂盒) (236 genes, 2 tubes, 7,194 amplicons) | Ion AmpliSeq Epilepsy Research Panel (癫痫研究试剂盒) (385 genes, 2 tubes, 8,875 amplicons) | Ion AmpliSeq Dysmorphia-Dysplasia Research Panel v2 (畸形-发育不良研究试剂盒) (519 genes, 2 tubes, 12,558 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Neurological Research Panel (神经疾病研究试剂盒) (751 genes, 2 tubes, 18,077 amplicons） | Ion AmpliSeq Noonan Research Panel (Noonan综合症研究试剂盒) (14 genes, 2 tubes, 268 amplicons) | Ion AmpliSeq CFTR Panel (囊性纤维化研究试剂盒) (1 gene, 2 tubes, 102 amplicons) | Ion Ampliseq Inhertied Disease （综合遗传病研究试 剂盒 (328 genes, 3 tubes, 10,309 amplicons） |
| Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 Panel (乳腺癌/卵巢癌研究试剂盒) (2 genes, 3 tubes, 167 amplicons) | Ion AmpliSeq BRCA Plus, Extended Hereditary Breast and Ovarian Research Panel (BRCA及其它基因相关的遗传性乳腺癌及卵巢癌研究试剂盒) (11 genes, 3 tubes, 699 amplicons) | Ion AmpliSeq Comprehensive Ovarian Cancer Research Panel (卵巢癌综合研究试剂盒) (41 genes, 2 tubes, 1,331 amplicons) | Ion AmpliSeq BRCA Reflex, Hereditary Cancer Research Panel (非BRCA相关的遗传性肿瘤研究试剂盒) (25 genes, 2 tubes, 610 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Inherited Cancer Research Panel(遗传性癌症研究试剂盒) (134 genes, 2 tubes, 3,340 amplicons) | Hematology Research Panel (血液疾病研究) (394 genes, tubes, 2 tubes,7,434 amplicons) | Ion AmpliSeq Exome RDY Kit (人类全外显子组研究试剂盒) | 根据需要个性化订制所需的试剂盒 (www.Ampliseq.com) |
所有商业化试剂盒均经过实验室验证，能提供具有优秀均一性（Uniformity）和上靶率的（on-target）遗传病靶向测序研究试剂盒（图4-1）。保证实验检测效能的同时，能大大减少用户的研发费用，缩短时间成本，协助客户快速开展相应的研究。
对于有特殊研究需求的用户，可以在友好化界面的Ampliseq Designer网站（www.Ampliseq.com），一键式订制自己感兴趣的试剂盒。用户仅需提供感兴趣的基因名称或区域，便可轻松构建特定的遗传病靶向测序研究panel。
例如，在心血管研究领域，用户可以根据疾病研究的需求，定制家族性高血脂症、继发性高血压、心肌病、马凡综合征等一系列遗传性心血管疾病的研究panel，帮助医生寻找患者的致病基因，继而开展合适的诊疗，并能进一步指导患者家庭的再生育。国内，目前已有多家医院利用Ion Torrent平台开展心血管疾病的研究工作。
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- 平均基因覆盖率：实验测到的panel中每个基因的碱基数占该基因全部碱基数比例的平均值；
- 阳性预测值：检测到的全部突变中真实突变所占的比例；
- 均一性：>20%平均测序深度时覆盖的碱基比例；
- 上靶Reads：每次运行全部产出Reads中匹配到目标区域的Reads所占的比例。
不仅是心血管研究领域，其他遗传疾病领域，均能通过客户定制，在Ion Torrent平台开展相应的研究工作。这里，我们和客户分享一个耳聋疾病领域的应用。
“中国聋病基因组计划” 是一个旨在更全方位地了解耳聋患者的病因，并给予个性化的咨询指导的项目。项目计划在全国范围内募集聋病患者，以高通量测序平台为主力，开展聋病患者及其家系样本的基因检测。项目拟在五年内完成10万-20万例聋病基因组研究，绘制中国人群耳聋基因图谱，制定临床聋病分子筛查与诊断指南，建立中国聋病遗传咨询体系。通过对收集的数据进行统计和汇总分析，建立中国聋病基因型与表型数据库，为患者提供全面的遗传咨询和临床指导。Ion Proton平台及AmpliSeq技术也将助力这一项目的开展。
国际上，也已经有许多实验室包括国家级科研项目，选择Ion Torrent平台，通过客户定制的方式，开展高通量的遗传疾病研究。沙特人类基因组计划计划（Saudi Human Genome Program, SHGP）就是一个例子。作
为一个高近亲结婚率（57%）的国家，沙特人群的遗传病呈现高发状态，其中仅孟德尔遗传病的发病率就高达8-14%。为了降低遗传病的发病率，沙特政府制定了沙特人类基因组计划，希望用5年时间完成10万人（正常和疾病组）的基因组测序和大规模人群队列遗传病研究。基于成本及检测周期的考量，该项目选择了Ion Torrent平台，并基于Ampliseq超高多重PCR技术设计多种遗传病研究Panel，包括内分泌疾病、24 心血管疾病、肾脏疾病、先天代谢异常等13大块领域。目前项目阶段成果已经发表于《Genome Biology》
(Saudi Mendeliome Group. Comprehensive gene panels provide advantages over clinical exome sequencing for Mendelian diseases. Genome Biology (2015) 16:134. DOI 10.1186/s13059-015-0693-2)。
Thermo Fisher作为一揽子整体平台的提供商，还为客户提供了多平台交叉验证的方案，以满足客户对使用第三方平台验证数据的需求。不论是使用商品化的试剂盒还是客户定制的panel，客户都可以基于Thermo Fisher的荧光定量，数字PCR或毛细管电泳平台，轻松的对突变进行多平台交叉验证。例如，使用荧光定量平台验证数据的客户，可以在Thermo Fisher已有的450万个即用型TaqMan™ SNP Genotyping Assays中选择合适探针设计，通过成熟的TaqMan Assay订制方案，轻松开展验证工作。而使用毛细管电泳的用户，可以使用我们已经优化好的流程，在无需另外消耗样本的同时，对突变位点开展验证工作。
3.2 遗传病检测芯片分析解决方案
AffyMetrix CytoScan HD /CytoScan 750K系列芯片和GCS 3000 Dx v.2 芯片扫描系统组合
Affymetrix GCS 3000Dx v.2基因扫描仪是唯一获得中国CFDA、美国FDA和欧盟CE-IVD三重认证的芯片平台。
CytoScan系列芯片包含CytoScan HD，CytoScan 750K和CytoScan Optima三款（表4-2）。其中CytoScan HD 和CytoScan 750K可用于遗传病检测，前者的探针密度大于后者，用户可根据所需检测目的和预期成本的不同进行灵活选择。
另外，客户可以根据自己的项目需求进行检测芯片的个性化订制。
胚胎植入前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）
胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening, PGS）是指辅助生殖过程中在胚胎植入着床前，早期胚胎进行染色体数目和结构异常的筛查，筛选无染色体缺陷的胚胎进行移植。提高移植成功率，减少如唐氏之类的染色体遗传病患儿的出生概率。
胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD）同样是辅助生殖过程中检测胚胎遗传物质是否存在异常的方法，与PGS的主要区别在于PGD主要是检测胚胎是否携带遗传缺陷基因，而PGS检测的是染色体数目和结构是否有异常。PGD尤其适用于本身携带有遗传缺陷基因的父母，对移植前的胚胎进行基因检测，从而选择无缺陷基因的胚胎进行移植，避免遗传疾病患儿的出生。
1. PGS的检测
目前市面常用的PGS检测方法有荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）技术、芯片比较基因组杂交技术（array comparative genome hybridization，aCGH）、单核苷酸多态性芯片分析（SNP array）和高通量测序等方法。FISH是最早的染色体异常的检测方法，无法一次性检测所有染色体，一般只能检测5条染色体，不能对全部23条染色体进行检测，不能做到真正意义的核型分析。芯片分析技术可以一次性对全基因组DNA的缺失和增加进行检测，是第一次实现真正意义的分析。高通量测序技术，使得测序成本大大降低，通过对覆盖到全部23条染色体的reads比例检测，不仅可以对全部染色体进行更加细致的检测，而且还可以发现一
些未知的染色体异常类型，包括染色体微小片段插入、缺失与重复、非平衡的结构异常等。
针对PGS的高通量测序法和芯片分析法，Thermo Fisher提供从仪器、试剂、软件和技术服务的全套完整解决方
案。
1.1 PGS高通量测序解决方案
Ion ReproSeq™ PGS 试剂盒和 Ion PGM™ 高通量测序系统组合
Ion ReproSeq PGS试剂盒结合最新的等温扩增模板制备试剂盒可快速、经济地筛查全部 24 条染色体的非整倍性（图4-1） 。此试剂盒仅需采用 6 pg 提取自单个细胞的 DNA，即可在短短 7.5 小时内精确检测全部的染色体及染色体臂情况 （>48 Mb）。Ion Torrent 系统可提供灵活的通量，使用户可同时经济地开展胚胎筛查胚胎，最大限度降低胚胎分批处理需求。配套的分析插件协助客户轻松完成数据分析（图4-2）。
1.2 PGS芯片分析解决方案
AffyMetrix CytoScan 系列芯片和GCS 3000 Dx v.2 芯片扫描系统组合
基于Affymetrix GCS 3000Dx v.2基因扫描仪平台的CytoScan系列芯片CytoScan HD，CytoScan 750K和CytoScan Optima均可用于PGS检测，用户可根据所需检测目的和预期成本的不同进行灵活选择（详见遗传病 部分表2）。
同时，支持客户根据自己的项目需求进行检测芯片的个性化订制。
2. PGD的检测
目前市面常用的单基因遗传疾病的检测方法有一代测序、多重PCR片段分析、芯片分析和高通量测序等方法。
一代测序和片段分析是最早的用于遗传病检测的手段，至今仍在应用的检测方法，适用于已知明确位点的检测，但由于通量较
小，不适合多点检测和未知疾病的发现。随着技术的不断发展，芯片技术和高通量测序技术可以解决传统方法无法解决的检测通
量问题和样本量问题，可以一次性的实现几百种遗传疾病位点的检测。
针对PGD的高通量测序法，客户可以通过已有的二十多种商业化Ion AmpliSeq遗传病检测试剂盒（详见遗传病部分介绍），或者根
据需要，在Ampliseq Designer网站（www.Ampliseq.com）提供感图4-3. PGD高通量检测流程兴趣的基因名称或区域，一键式订制自己感兴趣的检测试剂盒。
利用Ion Torrent平台，轻松实现对多基因多位点的检测，整个实验流程仅需2-3天（图4-3）。
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无创产前检测（ Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT）
无创产前检测（ Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT）是通过采集孕妇外周血，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析胎儿染色体数目结构信息，判断胎儿是否患有染色体疾病的检测方法。
1. 背景介绍和临床意义
我国是出生缺陷的高发国家，每年新增出生缺陷儿高达120万，约占每年出生人口总数4%-6%，胎儿染色体异常（如唐氏综合症（T21），爱德华综合征（T18）等）是临床最常见的出生缺陷类型之一，约占全部活产胎儿的1／500。这类疾病目前尚无有效的治疗方法，仅能通过产前筛查和产前诊断来进行预防。
2. 目前市面的检测手段
对于唐氏综合征等染色体异常疾病的筛查，临床常规的筛查方法是血清学鉴定法，而检测的金标准则是直接穿刺取胚胎活体组织进行细胞培养和核型鉴定。血清学的检测无创，但准确度低；羊水穿刺等活检技术虽是金标准，但却有着一定的流产风险。因此，基于高通量测序技术的NIPT检测技术，以其无创和99.9%的高准确率而被市场广泛认可（表4-2）。
3. 基于Ion Proton的NIPT检测
采用革新性的半导体芯片测序技术平台Ion Proton™，能实现在两个工作日内完成从血液样本到临床报告的NIPT实验流程。目前，三款基于Ion Torrent半导体测序技术的国产化高通量测序仪已获国家食品药品监督管理局（CFDA）批准的医疗器械注册证，提供从样本制备、测序到数据分析的整体解决方案，用于开展临床NIPT检测业务。
发育迟缓与智力障碍检测
The largest specific etiology of identification of developmental delay and intellectual disability is genetic(1). According to the American Academy of Neurology (AAN), the Child Neurology Society (CNS), the American College of Medical Genetics (ACMG), and the International Collaboration for Clinical Genomics (ISCA/ICCG), a chromosomal microarray analysis (CMA) is considered the first-line genetic test to aid in the diagnostic evaluation of ID when patient history and physical examination do not provide an obvious syndrome diagnosis(2-4). The CytoScan™ Dx Assay is the first IVD whole-genome diagnostic test to aid in identifying the underlying genetic cause of developmental delay, intellectual disability, congenital anomalies, or dysmorphic features in children.
CytoScan Dx Assay detects chromosomal aberrations across the whole genome
- This example illustrates two interstitial duplications: in blue, a 5 Mb duplication in 15q11.2->15q13.1; in red, a 1 Mb hemizygous gain in 16p13.11->16p13.11.
- Due to the high density of non-polymorphic (copy number) probes and polymorphic (SNP) markers in the array, the copy number changes can be visualized in the Log2 ratio track as well as confirmed in the allelic difference track.
- These microarray findings, in conjunction with clinical evaluation, led to a diagnosis of 15q11 microduplication syndrome.
CytoScan Dx Assay detects chromosomal aberrations of different sizes
CytoScan Dx Assay can accurately detect numerous chromosomal variations of different types, sizes, and genomic locations. In addition to identifying copy number changes, CytoScan Dx Assay is capable of detecting allelic imbalances and copy number neutral abnormalities such as AOH/LOH that can be associated with uniparental disomy (UPD) or consanguinity, both of which may pose increased risk for autosomal recessive conditions.
- This example shows two samples each with a hemizygous loss of 515 kb and 83 kb in cytoband 16p13.3 (indicated by red segments) that included the CREBBP OMIM gene. Both of these patients were diagnosed with Rubinstein-Taybi syndrome (RBS) based on clinical evaluation and CMA findings.
- Left, a sample with many LOH/AOH regions larger than 3 Mb, which may reflect consanguineous origin.
- Right, a clinically diagnosed Angelman syndrome sample with a typical LOH/AOH block, which is often caused by iso- UPD in this syndrome. In this particular case, the LOH/AOH spans the whole q-arm and is 79 Mb long.
- Individuals with large blocks of LOH/AOH may be at an increased risk for autosomal recessive conditions.
遗传病
1. 背景介绍和临床意义
目前，遗传病已成为人类健康的重大危害之一，越来越为人们所关注。遗传病可分为单基因病和多基因病，其中单基因病是遗传病中很重要的一个类型。单基因遗传病是由一对同源染色体上单个基因或一对等位基因发生突变所引起。目前已知的很多遗传病都属于单基因病，如血友症、耳聋、色盲、多指、并指、苯丙酮尿症、佝偻病等等。一些多基因病也存在较清晰的易感基因，如糖尿病、心血管疾病和癌症等等。遗传病一般困扰终生、难以治疗，有些即使可以治疗，费用也十分昂贵。因此，遗传疾病的检测，不仅对于个体遗传疾病风险的检测有重要意义，而且对于避免影响后代也具有重要意义。对于很多未知的疑难杂症也可以通过遗传病的检查发现其疾病的基因层面根源，进而开发个性化的治疗方案。这也是精准医疗的一个终极目标。
2. 目前市面的检测手段
目前，有多钟遗传病检测手段，例如Southern，定量PCR，一代测序，STR分型，连锁分析、芯片分析和二代测序等。
其中，以针对少量位点的一代测序和定量PCR等方法使用最广泛，但此类方法通量低，存在突变位点遗漏可能，因而仅适用于已知明确位点的检测，不适合多点检测和未知潜在疾病的发现。随着技术的不断发展，芯片技术和高通量测序技术可以解决传统方法无法解决的检测位点少和检测通量不足的问题，可以一次性的实现几百种遗传疾病位点的检测。
3. Thermo Fisher提供的遗传病检测完整解决方案
3.1 遗传病检测高通量测序解决方案
Ion AmpliSeq遗传病研究试剂盒和Ion Torrent高通量测序系统组合
目前，Thermo Fisher公司已经推出了25个基于开创性Ion AmpliSeq超高多重PCR技术的相关遗传病商业化研究试剂盒以及人类全外显子组检测试剂盒（表4-1），可用于人类遗传疾病的高通量检测和研究,，包括遗传性肿瘤的易感研究。这些试剂盒适用Ion Torrent所有高通量检测平台，每个试剂盒的基因列表信息详见www.
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表4-1. Ion Torrent高通量平台商业化遗传病检测方案汇总
| Ion AmpliSeq Cardiovascular Research Panel (心血管疾病研究试剂盒) (404 genes, 2 tubes, 10,430 amplicons) | Ion AmpliSeq Cardiac Arrhythmias and Cardiomyopathy Research Panel (心律不整及心肌症研究 试剂盒) (92 genes, 2 tubes, 2,198 amplicons） | Ion AmpliSeq Gastrointestinal Research Panel v2 (胃肠疾病研究试剂盒, v2) (194 genes, 2 tubes, 4,103 amplicons) | Ion AmpliSeq Renal Research Panel (肾脏疾病研究试剂盒v2) (154 genes, 2 tubes, 4,332 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Pulmonary Research Panel v2 (肺部疾病研究试剂盒v2) (131 genes, 2 tubes, 3,351amplicons) | Ion AmpliSeq Dermatology Research Panel v2 (皮肤病研究试剂盒v2) (222 genes, 2 tubes, 4,964 amplicons) | on AmpliSeq Endocrine Research Panel v2 (内分泌疾病研究试剂盒, v2) (340 genes, 2 tubes, 6,348 amplicons) | Ion AmpliSeq Inborn Errors of Metabolism Research Panel v2 (先天性代谢异常研究试剂盒, v2) (594 genes, 2 tubes, 9,681amplicons) |
| Ion AmpliSeq Primary Immune Deficiency Research Panel v2 (原发性免疫缺陷研究试剂盒 v2) (264 genes, 2 tubes, 5,241 amplicons) | Ion AmpliSeq Ophthalmic Research Panel (眼科疾病研究试剂盒) (316 genes, 2 tubes) | Ion AmpliSeq Hearing Loss Research Panel v1 (听力缺失研究试剂盒 v1) (63 genes, 2 tubes, 2,064 amplicons) | Ion AmpliSeq Deafness Research Panel v2 (耳聋研究试剂盒, v2) (122 genes, 2 tubes, 3,520 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Dementia Research Gene Panel (痴呆基因研究试剂盒) (17 genes, 2 tubes, 214 amplicons) | Ion AmpliSeq Autism Research Panel (孤独症研究试剂盒) (236 genes, 2 tubes, 7,194 amplicons) | Ion AmpliSeq Epilepsy Research Panel (癫痫研究试剂盒) (385 genes, 2 tubes, 8,875 amplicons) | Ion AmpliSeq Dysmorphia-Dysplasia Research Panel v2 (畸形-发育不良研究试剂盒) (519 genes, 2 tubes, 12,558 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Neurological Research Panel (神经疾病研究试剂盒) (751 genes, 2 tubes, 18,077 amplicons） | Ion AmpliSeq Noonan Research Panel (Noonan综合症研究试剂盒) (14 genes, 2 tubes, 268 amplicons) | Ion AmpliSeq CFTR Panel (囊性纤维化研究试剂盒) (1 gene, 2 tubes, 102 amplicons) | Ion Ampliseq Inhertied Disease （综合遗传病研究试 剂盒 (328 genes, 3 tubes, 10,309 amplicons） |
| Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 Panel (乳腺癌/卵巢癌研究试剂盒) (2 genes, 3 tubes, 167 amplicons) | Ion AmpliSeq BRCA Plus, Extended Hereditary Breast and Ovarian Research Panel (BRCA及其它基因相关的遗传性乳腺癌及卵巢癌研究试剂盒) (11 genes, 3 tubes, 699 amplicons) | Ion AmpliSeq Comprehensive Ovarian Cancer Research Panel (卵巢癌综合研究试剂盒) (41 genes, 2 tubes, 1,331 amplicons) | Ion AmpliSeq BRCA Reflex, Hereditary Cancer Research Panel (非BRCA相关的遗传性肿瘤研究试剂盒) (25 genes, 2 tubes, 610 amplicons) |
| Ion AmpliSeq Inherited Cancer Research Panel(遗传性癌症研究试剂盒) (134 genes, 2 tubes, 3,340 amplicons) | Hematology Research Panel (血液疾病研究) (394 genes, tubes, 2 tubes,7,434 amplicons) | Ion AmpliSeq Exome RDY Kit (人类全外显子组研究试剂盒) | 根据需要个性化订制所需的试剂盒 (www.Ampliseq.com) |
所有商业化试剂盒均经过实验室验证，能提供具有优秀均一性（Uniformity）和上靶率的（on-target）遗传病靶向测序研究试剂盒（图4-1）。保证实验检测效能的同时，能大大减少用户的研发费用，缩短时间成本，协助客户快速开展相应的研究。
对于有特殊研究需求的用户，可以在友好化界面的Ampliseq Designer网站（www.Ampliseq.com），一键式订制自己感兴趣的试剂盒。用户仅需提供感兴趣的基因名称或区域，便可轻松构建特定的遗传病靶向测序研究panel。
例如，在心血管研究领域，用户可以根据疾病研究的需求，定制家族性高血脂症、继发性高血压、心肌病、马凡综合征等一系列遗传性心血管疾病的研究panel，帮助医生寻找患者的致病基因，继而开展合适的诊疗，并能进一步指导患者家庭的再生育。国内，目前已有多家医院利用Ion Torrent平台开展心血管疾病的研究工作。
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- 平均基因覆盖率：实验测到的panel中每个基因的碱基数占该基因全部碱基数比例的平均值；
- 阳性预测值：检测到的全部突变中真实突变所占的比例；
- 均一性：>20%平均测序深度时覆盖的碱基比例；
- 上靶Reads：每次运行全部产出Reads中匹配到目标区域的Reads所占的比例。
不仅是心血管研究领域，其他遗传疾病领域，均能通过客户定制，在Ion Torrent平台开展相应的研究工作。这里，我们和客户分享一个耳聋疾病领域的应用。
“中国聋病基因组计划” 是一个旨在更全方位地了解耳聋患者的病因，并给予个性化的咨询指导的项目。项目计划在全国范围内募集聋病患者，以高通量测序平台为主力，开展聋病患者及其家系样本的基因检测。项目拟在五年内完成10万-20万例聋病基因组研究，绘制中国人群耳聋基因图谱，制定临床聋病分子筛查与诊断指南，建立中国聋病遗传咨询体系。通过对收集的数据进行统计和汇总分析，建立中国聋病基因型与表型数据库，为患者提供全面的遗传咨询和临床指导。Ion Proton平台及AmpliSeq技术也将助力这一项目的开展。
国际上，也已经有许多实验室包括国家级科研项目，选择Ion Torrent平台，通过客户定制的方式，开展高通量的遗传疾病研究。沙特人类基因组计划计划（Saudi Human Genome Program, SHGP）就是一个例子。作
为一个高近亲结婚率（57%）的国家，沙特人群的遗传病呈现高发状态，其中仅孟德尔遗传病的发病率就高达8-14%。为了降低遗传病的发病率，沙特政府制定了沙特人类基因组计划，希望用5年时间完成10万人（正常和疾病组）的基因组测序和大规模人群队列遗传病研究。基于成本及检测周期的考量，该项目选择了Ion Torrent平台，并基于Ampliseq超高多重PCR技术设计多种遗传病研究Panel，包括内分泌疾病、24 心血管疾病、肾脏疾病、先天代谢异常等13大块领域。目前项目阶段成果已经发表于《Genome Biology》
(Saudi Mendeliome Group. Comprehensive gene panels provide advantages over clinical exome sequencing for Mendelian diseases. Genome Biology (2015) 16:134. DOI 10.1186/s13059-015-0693-2)。
Thermo Fisher作为一揽子整体平台的提供商，还为客户提供了多平台交叉验证的方案，以满足客户对使用第三方平台验证数据的需求。不论是使用商品化的试剂盒还是客户定制的panel，客户都可以基于Thermo Fisher的荧光定量，数字PCR或毛细管电泳平台，轻松的对突变进行多平台交叉验证。例如，使用荧光定量平台验证数据的客户，可以在Thermo Fisher已有的450万个即用型TaqMan™ SNP Genotyping Assays中选择合适探针设计，通过成熟的TaqMan Assay订制方案，轻松开展验证工作。而使用毛细管电泳的用户，可以使用我们已经优化好的流程，在无需另外消耗样本的同时，对突变位点开展验证工作。
3.2 遗传病检测芯片分析解决方案
AffyMetrix CytoScan HD /CytoScan 750K系列芯片和GCS 3000 Dx v.2 芯片扫描系统组合
Affymetrix GCS 3000Dx v.2基因扫描仪是唯一获得中国CFDA、美国FDA和欧盟CE-IVD三重认证的芯片平台。
CytoScan系列芯片包含CytoScan HD，CytoScan 750K和CytoScan Optima三款（表4-2）。其中CytoScan HD 和CytoScan 750K可用于遗传病检测，前者的探针密度大于后者，用户可根据所需检测目的和预期成本的不同进行灵活选择。
另外，客户可以根据自己的项目需求进行检测芯片的个性化订制。
胚胎植入前遗传学诊断/筛查（PGD/PGS）
胚胎植入前遗传学筛查（Preimplantation Genetic Screening, PGS）是指辅助生殖过程中在胚胎植入着床前，早期胚胎进行染色体数目和结构异常的筛查，筛选无染色体缺陷的胚胎进行移植。提高移植成功率，减少如唐氏之类的染色体遗传病患儿的出生概率。
胚胎植入前基因诊断（Preimplantation Genetic Diagnosis, PGD）同样是辅助生殖过程中检测胚胎遗传物质是否存在异常的方法，与PGS的主要区别在于PGD主要是检测胚胎是否携带遗传缺陷基因，而PGS检测的是染色体数目和结构是否有异常。PGD尤其适用于本身携带有遗传缺陷基因的父母，对移植前的胚胎进行基因检测，从而选择无缺陷基因的胚胎进行移植，避免遗传疾病患儿的出生。
1. PGS的检测
目前市面常用的PGS检测方法有荧光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH）技术、芯片比较基因组杂交技术（array comparative genome hybridization，aCGH）、单核苷酸多态性芯片分析（SNP array）和高通量测序等方法。FISH是最早的染色体异常的检测方法，无法一次性检测所有染色体，一般只能检测5条染色体，不能对全部23条染色体进行检测，不能做到真正意义的核型分析。芯片分析技术可以一次性对全基因组DNA的缺失和增加进行检测，是第一次实现真正意义的分析。高通量测序技术，使得测序成本大大降低，通过对覆盖到全部23条染色体的reads比例检测，不仅可以对全部染色体进行更加细致的检测，而且还可以发现一
些未知的染色体异常类型，包括染色体微小片段插入、缺失与重复、非平衡的结构异常等。
针对PGS的高通量测序法和芯片分析法，Thermo Fisher提供从仪器、试剂、软件和技术服务的全套完整解决方
案。
1.1 PGS高通量测序解决方案
Ion ReproSeq™ PGS 试剂盒和 Ion PGM™ 高通量测序系统组合
Ion ReproSeq PGS试剂盒结合最新的等温扩增模板制备试剂盒可快速、经济地筛查全部 24 条染色体的非整倍性（图4-1） 。此试剂盒仅需采用 6 pg 提取自单个细胞的 DNA，即可在短短 7.5 小时内精确检测全部的染色体及染色体臂情况 （>48 Mb）。Ion Torrent 系统可提供灵活的通量，使用户可同时经济地开展胚胎筛查胚胎，最大限度降低胚胎分批处理需求。配套的分析插件协助客户轻松完成数据分析（图4-2）。
1.2 PGS芯片分析解决方案
AffyMetrix CytoScan 系列芯片和GCS 3000 Dx v.2 芯片扫描系统组合
基于Affymetrix GCS 3000Dx v.2基因扫描仪平台的CytoScan系列芯片CytoScan HD，CytoScan 750K和CytoScan Optima均可用于PGS检测，用户可根据所需检测目的和预期成本的不同进行灵活选择（详见遗传病 部分表2）。
同时，支持客户根据自己的项目需求进行检测芯片的个性化订制。
2. PGD的检测
目前市面常用的单基因遗传疾病的检测方法有一代测序、多重PCR片段分析、芯片分析和高通量测序等方法。
一代测序和片段分析是最早的用于遗传病检测的手段，至今仍在应用的检测方法，适用于已知明确位点的检测，但由于通量较
小，不适合多点检测和未知疾病的发现。随着技术的不断发展，芯片技术和高通量测序技术可以解决传统方法无法解决的检测通
量问题和样本量问题，可以一次性的实现几百种遗传疾病位点的检测。
针对PGD的高通量测序法，客户可以通过已有的二十多种商业化Ion AmpliSeq遗传病检测试剂盒（详见遗传病部分介绍），或者根
据需要，在Ampliseq Designer网站（www.Ampliseq.com）提供感图4-3. PGD高通量检测流程兴趣的基因名称或区域，一键式订制自己感兴趣的检测试剂盒。
利用Ion Torrent平台，轻松实现对多基因多位点的检测，整个实验流程仅需2-3天（图4-3）。
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无创产前检测（ Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT）
无创产前检测（ Non-Invasive Prenatal Testing, NIPT）是通过采集孕妇外周血，提取游离DNA，采用新一代高通量测序技术，结合生物信息分析胎儿染色体数目结构信息，判断胎儿是否患有染色体疾病的检测方法。
1. 背景介绍和临床意义
我国是出生缺陷的高发国家，每年新增出生缺陷儿高达120万，约占每年出生人口总数4%-6%，胎儿染色体异常（如唐氏综合症（T21），爱德华综合征（T18）等）是临床最常见的出生缺陷类型之一，约占全部活产胎儿的1／500。这类疾病目前尚无有效的治疗方法，仅能通过产前筛查和产前诊断来进行预防。
2. 目前市面的检测手段
对于唐氏综合征等染色体异常疾病的筛查，临床常规的筛查方法是血清学鉴定法，而检测的金标准则是直接穿刺取胚胎活体组织进行细胞培养和核型鉴定。血清学的检测无创，但准确度低；羊水穿刺等活检技术虽是金标准，但却有着一定的流产风险。因此，基于高通量测序技术的NIPT检测技术，以其无创和99.9%的高准确率而被市场广泛认可（表4-2）。
3. 基于Ion Proton的NIPT检测
采用革新性的半导体芯片测序技术平台Ion Proton™，能实现在两个工作日内完成从血液样本到临床报告的NIPT实验流程。目前，三款基于Ion Torrent半导体测序技术的国产化高通量测序仪已获国家食品药品监督管理局（CFDA）批准的医疗器械注册证，提供从样本制备、测序到数据分析的整体解决方案，用于开展临床NIPT检测业务。
发育迟缓与智力障碍检测
The largest specific etiology of identification of developmental delay and intellectual disability is genetic(1). According to the American Academy of Neurology (AAN), the Child Neurology Society (CNS), the American College of Medical Genetics (ACMG), and the International Collaboration for Clinical Genomics (ISCA/ICCG), a chromosomal microarray analysis (CMA) is considered the first-line genetic test to aid in the diagnostic evaluation of ID when patient history and physical examination do not provide an obvious syndrome diagnosis(2-4). The CytoScan™ Dx Assay is the first IVD whole-genome diagnostic test to aid in identifying the underlying genetic cause of developmental delay, intellectual disability, congenital anomalies, or dysmorphic features in children.
CytoScan Dx Assay detects chromosomal aberrations across the whole genome
- This example illustrates two interstitial duplications: in blue, a 5 Mb duplication in 15q11.2->15q13.1; in red, a 1 Mb hemizygous gain in 16p13.11->16p13.11.
- Due to the high density of non-polymorphic (copy number) probes and polymorphic (SNP) markers in the array, the copy number changes can be visualized in the Log2 ratio track as well as confirmed in the allelic difference track.
- These microarray findings, in conjunction with clinical evaluation, led to a diagnosis of 15q11 microduplication syndrome.
CytoScan Dx Assay detects chromosomal aberrations of different sizes
CytoScan Dx Assay can accurately detect numerous chromosomal variations of different types, sizes, and genomic locations. In addition to identifying copy number changes, CytoScan Dx Assay is capable of detecting allelic imbalances and copy number neutral abnormalities such as AOH/LOH that can be associated with uniparental disomy (UPD) or consanguinity, both of which may pose increased risk for autosomal recessive conditions.
- This example shows two samples each with a hemizygous loss of 515 kb and 83 kb in cytoband 16p13.3 (indicated by red segments) that included the CREBBP OMIM gene. Both of these patients were diagnosed with Rubinstein-Taybi syndrome (RBS) based on clinical evaluation and CMA findings.
- Left, a sample with many LOH/AOH regions larger than 3 Mb, which may reflect consanguineous origin.
- Right, a clinically diagnosed Angelman syndrome sample with a typical LOH/AOH block, which is often caused by iso- UPD in this syndrome. In this particular case, the LOH/AOH spans the whole q-arm and is 79 Mb long.
- Individuals with large blocks of LOH/AOH may be at an increased risk for autosomal recessive conditions.