SeqStudio Flex基因分析仪

通过聚合酶链式反应(PCR)进行DNA序列扩增，仍然是所有分子生物学研究和基因组研究的主要方法。 对单个样本进行多靶标分析的需求在不断增加，然而由于需要为每个所需靶标建立不同的反应，使用PCR进行分析可能比较繁琐，。能够分析单个样本中多个序列的方法，不但可以简化工作流程，而且还能保护珍贵的样品。其中一个方法就是毛细管电泳(CE)多重荧光片段分析法。毛细管电泳根据单个毛细管中扩增子的大小和荧光剂分离扩增子，从而分析单个样本中的多个靶标。

多重PCR结合荧光片段分析法提供了以最低成本或最小工作量进行复杂分析的最佳机会。实验受限于是否能够设计所分析靶标的引物组。因此，这一方法几乎能够适应并应用于任何场景，有望在这些场景中检测单个样本的多个靶序列。

This example demonstrates the power of multiplexed PCR by fragment analysis using a custom panel for detecting respiratory viral pathogens.  A panel of PCR primers containing 6-FAM labeling at the 5’-end were designed to detect 12 different respiratory RNA viruses, including rhinovirus, RSV-B, influenza A H1, influenza A H3, influenza B, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus OC43, and coronavirus 229E, as well as SARS-CoV-2 S, N, and orf1ab, so that each organism generated a different sized amplicon.  The resulting amplicons could be separated and examined using the SeqStudio, SeqStudio 24 Flex, or 3500xL genetic analyzers.

在开始基因组分析或继续下一步之前，通常需要对起始的双链DNA（dsDNA）池进行质量控制（QC）。例如，从FFPE保存组织中提取的DNA可能呈现碎片化，并且由于太小而无法提供有用信息，因此在继续操作之前，了解其整体大小很有用。

双链DNA片段的大小和相对丰度可以在SeqStudio Flex系列基因分析仪上进行分析。在该方案中，TOTO-1是一种荧光DNA嵌入染料，与样本一起孵育，样本在毛细管加热器关闭的情况下通过POP7聚合物运行。（这使DNA大部分保持在双链、非变性状态。）通过将测试片段的迁移结果与已知双链DNA标准的迁移进行比较，可以确定测试片段的大小。

在该试验中，我们评估了SeqStudio Flex基因分析仪和3500xL基因分析仪在分析多种DNA样本时的性能，包括图中所示两种已知的双链DNA标准。板A说明了用HindIII消化的噬菌体lambda DNA的分析，显示了从23,130至125 bp的八个片段的熟悉模式。板B显示了相同lambda HindIII消化物与用BsuRI消化的噬菌体phiX174的混合物。除了8个lambda片段外，还检测到10个从1,353至72 bp的片段。在SeqStudio Flex（左）和3500xL（右）仪器上获得的配置文件高度相似，对新仪器与3500系列的对比进行了验证。

一些研究需要基因组特定区域的序列信息。虽然NGS等全基因组工具在非常大的区域内提供了大量数据，但在重点研究中并不总是需要这种复杂方法。Sanger金标准测序提供了一种简单、经济、易于分析的解决方案。

比如，我们对SARS-CoV-2基因组中包含Spike 蛋白和相邻序列的区域进行了测序，这依赖于之前为整个SARS-CoV-2 Spike基因确定12对测序引物的研究。被12个扩增子覆盖的SARS-CoV-2的Spike基因区域延伸至5 kb。

在板A中（如图所示），两个方向几乎所有12个扩增子都获得了高质量的Sanger测序结果（由浅蓝色条的高度表示）。

这些结果被整合到SARS-CoV-2 Spike基因的单个重叠中读段。三台分析仪上的测序质量指标几乎相同。如图所示，碱基识别的可靠稳定使Sanger测序能够使用重叠的中长扩增子组装靶向区域的序列，生成覆盖感兴趣基因座的序列。