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PSC 多巴胺能神经元分化试剂盒
产品概览及工作流程：
在分化过程中，hPSC 会首先在底板规格 培养基中被诱导成中脑特异性的底板前体 (FP) 细胞。接下来，FP 细胞会在 底板细胞扩增培养基中作为贴壁培养细胞扩增并随后进行悬浮培养以形成球状体。最终，球状体会在 多巴胺能神经元的成熟培养基中分化为成熟的多巴胺能神经元。整个分化工作流程大约需要 35 天 （图 1） 。
图 1.简化的工作流程图。在基本 8 培养基中培养的多能干细胞可被特异性诱导成中脑底板、扩增并储存起来，随后成熟为中脑多巴胺能神经元，为期约35天。
- 以基本 8 培养基中的 PSC 为起始材料
- 当细胞达到最高 80% 汇合度时开始特异性诱导
- 每 2 天更换一次培养基
- 将细胞进行分散并在扩增培养基中重新接种
- 每 2 天进行一次细胞补液
- 细胞可在第 16 天冻存或储存起来，或持续培养至第 20 天使之成熟
- 将细胞进行分散并在熟化培养基中重新接种
- 每 2 天进行一次细胞补液
- 神经元最早可在第 30 天观察到；最佳的结果是在第 35 天
在这一步中，PSC 会向着中脑底板发展。
在中枢神经系统发育过程中，中脑多巴胺能神经元来源于一种称为中脑底板细胞的独特细胞群，后者在孕期第 21-28 天形成并沿着正在发育的神经管腹侧中线而分布。近期的报道聚焦于鉴定出合适的 体外 条件来将 hPSC 分化成正确分区的底板前体细胞，而非更为通用的神经干细胞群，目的是为了制备真正的 DA 神经元。多巴胺能神经元分化的第一步是在玻连蛋白包被的培养板上将完全底板规格培养基中的 hPSC 特异性诱导成中脑特异性底板前体 (FP) 细胞。在特异性诱导过程中，每隔一天需要用新鲜的完全诱导培养基换液，并在第 10 天进行 FP 细胞的收集以开始扩增阶段。
图 2.诱导底板前体 (FP) 细胞的标记物表达。用底板规格完全培养基处理 hPSC 7 天，并对细胞中人多巴胺能神经元谱系的关键表型标志物进行分析。(A–C) 在 hPSC 进行底板细胞特异性诱导后，细胞会表达 FP 标记物 FOXA2（绿色）以及喙侧标志物 OTX2（红色）。(D–E) 特异性诱导的 FP 细胞的 DA 前体标记物 LMX1A（绿色）呈阳性，但其神经干细胞标志物 SOX1（红色）则呈阴性。中脑底板前体细胞表型的关键标记物 FOXA2 和 OTX2 的表达（图 2）最早可在诱导第 7 天检测到。如需进行基于图像的中间底板前体分析，我们推荐使用人多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒，其中含有一组完全的一抗和二抗、核 DNA 染料以及预制缓冲液，可优化染色实验。
该步骤可实现对前体细胞的储存并显著提高产出的 DA 神经元纯度。 标准的中脑多巴胺能神经元制备方法包含冗长的连续操作步骤且不可扩展。在这一步对前体细胞进行储存，可带来如下优势：
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图 3.中脑底板前体细胞扩增显著提高了产出 DA 神经元的纯度。
图 4.扩增后中脑标记物的维持：扩增的底板细胞维持其表型。（A）从 Gibco 游离体诱导多能干细胞生成且经过传代的底板细胞的图像。（B-F）扩增的细胞维持了 FOXA2、LMX1A 及 OTX2 表型标记物。84.90 ± 6.95% 的细胞呈现 FOXA2 及 OTX2 双阳性染色。
该步可将中脑底板细胞成熟为 TH 阳性的多巴胺能神经元。
实验显示，在该步生成的多巴胺能神经元可维持中脑的特性、具有与已经发表的实验方法生成的神经元相同的基因表达谱，并展现出自发性动作电位以及在去极化时释放多巴胺的功能性。在这一步生成的细胞表型可通过使用 PSC 多巴胺能神经元 ICC 试剂盒进行确认，随后便能用于下游的检测。
图 5.成熟 DA 神经元的代表性图像。以下图像是在加入 多巴胺能神经元成熟完全培养基后第 14 天，用人多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒随附染色试剂而获得的。大部分表达 TH 的神经元也共表达了 FOXA2。（A）抗 TH（绿色）。（B）抗 FOXA2（红色）及 NucBlue 染色（核 DNA DAPI染色）（蓝色）。（C）抗 TH 与抗 FOXA2（绿色与红色）的合并图像。
图 6.关键基因的基因表达谱与通过发表的实验方法而生成的神经元相当（Kriks 分化后第 48 天与 DA 神经元分化后第 35 天）。
在这一步中，PSC 会向着中脑底板发展。
在中枢神经系统发育过程中，中脑多巴胺能神经元来源于一种称为中脑底板细胞的独特细胞群，后者在孕期第 21-28 天形成并沿着正在发育的神经管腹侧中线而分布。近期的报道聚焦于鉴定出合适的 体外 条件来将 hPSC 分化成正确分区的底板前体细胞，而非更为通用的神经干细胞群，目的是为了制备真正的 DA 神经元。多巴胺能神经元分化的第一步是在玻连蛋白包被的培养板上将完全底板规格培养基中的 hPSC 特异性诱导成中脑特异性底板前体 (FP) 细胞。在特异性诱导过程中，每隔一天需要用新鲜的完全诱导培养基换液，并在第 10 天进行 FP 细胞的收集以开始扩增阶段。
图 2.诱导底板前体 (FP) 细胞的标记物表达。用底板规格完全培养基处理 hPSC 7 天，并对细胞中人多巴胺能神经元谱系的关键表型标志物进行分析。(A–C) 在 hPSC 进行底板细胞特异性诱导后，细胞会表达 FP 标记物 FOXA2（绿色）以及喙侧标志物 OTX2（红色）。(D–E) 特异性诱导的 FP 细胞的 DA 前体标记物 LMX1A（绿色）呈阳性，但其神经干细胞标志物 SOX1（红色）则呈阴性。中脑底板前体细胞表型的关键标记物 FOXA2 和 OTX2 的表达（图 2）最早可在诱导第 7 天检测到。如需进行基于图像的中间底板前体分析，我们推荐使用人多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒，其中含有一组完全的一抗和二抗、核 DNA 染料以及预制缓冲液，可优化染色实验。
该步骤可实现对前体细胞的储存并显著提高产出的 DA 神经元纯度。 标准的中脑多巴胺能神经元制备方法包含冗长的连续操作步骤且不可扩展。在这一步对前体细胞进行储存，可带来如下优势：
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图 3.中脑底板前体细胞扩增显著提高了产出 DA 神经元的纯度。
图 4.扩增后中脑标记物的维持：扩增的底板细胞维持其表型。（A）从 Gibco 游离体诱导多能干细胞生成且经过传代的底板细胞的图像。（B-F）扩增的细胞维持了 FOXA2、LMX1A 及 OTX2 表型标记物。84.90 ± 6.95% 的细胞呈现 FOXA2 及 OTX2 双阳性染色。
该步可将中脑底板细胞成熟为 TH 阳性的多巴胺能神经元。
实验显示，在该步生成的多巴胺能神经元可维持中脑的特性、具有与已经发表的实验方法生成的神经元相同的基因表达谱，并展现出自发性动作电位以及在去极化时释放多巴胺的功能性。在这一步生成的细胞表型可通过使用 PSC 多巴胺能神经元 ICC 试剂盒进行确认，随后便能用于下游的检测。
图 5.成熟 DA 神经元的代表性图像。以下图像是在加入 多巴胺能神经元成熟完全培养基后第 14 天，用人多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒随附染色试剂而获得的。大部分表达 TH 的神经元也共表达了 FOXA2。（A）抗 TH（绿色）。（B）抗 FOXA2（红色）及 NucBlue 染色（核 DNA DAPI染色）（蓝色）。（C）抗 TH 与抗 FOXA2（绿色与红色）的合并图像。
图 6.关键基因的基因表达谱与通过发表的实验方法而生成的神经元相当（Kriks 分化后第 48 天与 DA 神经元分化后第 35 天）。
功能性中脑多巴胺能神经元
测定所得中脑多巴胺能神经元的功能（图 7 与 8）。
图 7.通过 HPLC 评估分化神经元中的自发性及去极化诱导的多巴胺释放。通过 HPLC 测定自发性及由去极化诱导的多巴胺释放，以评估分化神经元的功能。中脑 FP 细胞及神经干细胞分化 2 周。收集条件培养基（第 12 至 14 天），测定自发性多巴胺释放。在 37°C 将 DA 神经元在 Hank 平衡盐溶液 (HBSS) 或含有 56 mM Kcl 的 HBSS 中孵育 15 分钟，可实现去极化诱导的多巴胺释放。分化的 DA 神经元不仅能产生多巴胺（条件培养基），还可通过加入过量 K+ 引起的电压门控刺激释放多巴胺。
图 8.通过 MEA（多电极阵列）评估分化的神经元中的自发性动作电位。iPSC 分化的中脑 FP 细胞接种于 MEA 培养板并成熟10 天以上。（A）活动图展示了被检测到的放电量级。（B）放电窗格展示了被检测到的放电电压波型。多电极阵列 (Axion) 记录到自发性动作电位，表明细胞群为具有电生理活性的神经元。
多巴胺能神经元的表征
如需进行基于图像的成熟 DA 神经元分析，我们推荐使用人多巴胺能神经元免疫细胞化学试剂盒，其含有一组完全的一抗和二抗、核 DNA 染料以及预制缓冲液，可优化染色实验。
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