1．如何保存引物？
2．如何测定引物的OD值？
3．如何检测引物的纯度？
4．为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？
5．如何计算引物的Tm值？
6．Primer设计的基本原则是什么？
7．TaqMan 探针设计的基本原则是什么？


1．如何保存引物？

我们提供的干粉DNA从有机溶剂中干燥出来，无菌，无核酸酶。可以室温或-20℃密闭长期保存。

溶解以后的DNA最好保存在-20℃，溶解引物的水的PH要求大于7，并且无菌。带有荧光标记的引物请注意避光保存。

2．如何测定引物的OD值？

用紫外分光光度计在260nm波长测定溶液的光密度来定量。请注意紫外分光光度计的使用，测定时溶液的光密度最好稀释到0.2-0.8之间。DNA干粉用一定体积的水充分振荡溶解以后，取部分溶液稀释到1ml并在1ml标准比色杯中测定其光密度，即为所测体积的OD值，进而可以计算出母液的OD值。

举例：您拿到一管干粉的DNA，用1ml水溶解成母液，取该母液50微升稀释成1ml并在1ml标准比色杯中测定的光密度为0.25，说明该50微升中含有0.25OD的DNA，也即说明原来1ml母液中含有5OD的DNA。

3．如何检测引物的纯度？

实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取0.2-0.5OD的引物，用尿素饱和液溶解或引物溶液中加入尿素干粉直到饱和，上样前加热变性(95oC,2mins)。加入尿素的目的一是变性，二是增加样品比重，容易加样。600V电压进行电泳，一定时间后(约2-3小时)，剥胶，用荧光TLC板在紫外灯下检测带型，在主带之下没有杂带，说明纯度是好的。(有时由于变性不充分，主带之上可能会有条带，乃是引物二级结构条带。)

4．为什么说用EB染色合成DNA片段来定量是不正确的？

通常可以用EB染色的方法来判断双链DNA的量(如质粒DNA)，是因为EB可以嵌合到双链DNA中。而合成的单链DNA，由于碱基组成不同，形成二级结构的可能性不同，EB的染色程度也会不同，比如Oligo(dT)等不形成二级结构，EB根本无法染色。所以不要用EB染色的方法来定量，而用紫外分光光度计检测。同样道理，用EB染色来照片不适合所有引物。

5．如何计算引物的Tm值？

引物设计软件都可以给出Tm，引物长度，碱基组成，引物使用缓冲的离子强度有关。
长度为25mer以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size
公式中，Size = 引物长度。上下游引物的Tm值（melting temperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。

6．Primer设计的基本原则是什么？

  • 引物长度一般在18-35mer。
  • G-C含量控制在40-60%左右。
  • 避免近3’端有酶切位点或发夹结构。
  • 如果可能避免在3’端最后5个碱基有2个以上的G或C。
  • 如果可能避免在3’端最后1个碱基为A。
  • 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
  • 退火温度Tm控制在 58-60C左右。
  • 如果是设计点突变引物，突变点应尽可能在引物的中间。

7．TaqMan 探针设计的基本原则是什么？

  • TaqMan 探针位置尽可能靠近扩增引物（扩增产物50-150bp），但不能与引物重叠。
  • 长度一般为18-40mer 。
  • G-C含量控制在40-80%左右。
  • 避免连续相同碱基的出现，特别是要避免GGGG或更多G出现。
  • 在引物的5’端避免使用G。
  • 选用比较多的碱基C。
  • 退火温度Tm控制在 68-70℃左右。