在基于 TaqMan® 和 SYBR® Green 的实时 PCR 中，借助 Cells-to-CT™ 试剂盒可直接对培养细胞进行实时 RT-PCR 分析，无需 RNA 纯化。Cells-to-CT 系统采用专有方法裂解培养细胞，同时去除基因组 DNA 并保持 RNA 完整性，因而与需要 RNA 纯化的传统方法相比，节省了大量时间和精力。在此，Applied Biosystems 研究员证明了 Cells-to-CT 方法可以轻松实现高通量基因表达分析的自动化。

简单的可自动化程序

在基于 TaqMan® 和 SYBR® Green 的实时 PCR 中，借助 Cells-to-CT™ 试剂盒可直接使用培养细胞进行基因表达分析，无需 RNA 纯化。可直接在96或384孔培养容器中对细胞进行处理，处理过程包括2个步骤，仅需7分钟，无需进行 RNA 分离通常所需的加热、离心或真空过滤程序（图1）。Cells-to-CT 方法简单，非常适用于即使是最基本的自动化液体处理系统。自动化可减少人力和塑料制品消耗，极大程度地降低交叉污染、样本损失和其他人为错误的可能性。因此，自动化 Cells-to-CT 实验方案为研究人员提供了较简单、重现性较佳的基因表达分析工作流程，适用于高通量项目。使用常用的自动化系统，Cells-to-CT 试剂盒可在不到10分钟内自动制备384份独特的细胞样本用于进行实时 RT-PCR，即每份样本用时不到1.5秒！

 

（点击图片放大）

图1.Cells-to-CT™ 试剂盒：仅需7分钟即可进行 RT。

无需混合样本

在使用 Cells-to-CT 试剂盒手动处理细胞的实验方案中，建议在加入裂解液和终止液后混合样本。为促进程序的自动化，我们研究了使用 TaqMan 基因表达 Cells-to-CT 试剂盒时是否需要这些样本混合步骤才可获得可重现的高质量实时 PCR 数据。加入裂解液和终止液后，对样本进行以下处理：通过5次移液进行混合（标准推荐方案）、振摇30秒或不混合。在这些不同的样本混合条件下获得非常相似的 CT 值和重现性水平（图2），表明对于小规模的 HeLa 细胞样本，可在 Cells-to-CT 样本制备程序中省略混合步骤。（注：此数据源自4,000个相对容易裂解的 HeLa 细胞。其他细胞系和不同细胞数量可能会产生不同的结果。在进行更大规模的实验之前，应使用实验系统中的细胞系和数量评价无混合实验方案）。省略这些混合步骤不仅可以简化并加快实验程序，而且还具有额外优点，即明显减少了该程序所需的移液器吸头数量。因此，实验程序更快、更经济且步骤更少。

 


图2.使用 TaqMan® 基因表达 Cells-to-CT™ 试剂盒在不同的混合处理条件下获得相似结果。按照试剂盒随附的说明处理16份重复样本，每份样本包含4,000个 HeLa 细胞。加入裂解液和终止液后，对样本进行以下处理：振摇30秒、通过5次移液进行混合，或完全不混合。然后使用 TaqMan 基因表达检测试剂盒，对裂解物进行实时 RT-PCR 以测定 18S rRNA 或 β-肌动蛋白。在任何混合处理条件下均可获得相似的平均 Ct 值，表明可以从实验方案中省略混合步骤，以减少吸头用量和成本。（注意，误差线代表16份生物重复样本平均值的标准偏差。

可重现结果

在 Biomek® FX 工作站上自动执行 Cells-to-CT 无混合程序，可得到与标准手动 Cells-to-CT 方法同等灵敏度和可重现性的基因表达数据，同时减少人力并极大限度地减少交叉污染。图3显示了利用自动化程序实现的宽动态范围、高灵敏度和出色重现性。图4显示了采用自动化方案可极大程度地减少交叉污染。所得的裂解物可与已优化的全部 Applied Biosystems TaqMan 和 SYBR Green PCR 预混液相容。

 

 

图3.自动化 Cells-to-CT™ 程序可获得灵敏、可重现的表达数据。使用 TaqMan® Cells-to-CT 试剂盒和 TaqMan 基因表达检测试剂盒，测定96孔平底组织培养板中每种 MCF-7 细胞浓度下16份生物样本的 β-肌动蛋白（橙色方块）、18S（蓝色圆圈）和 LDHA（绿色三角形）的平均 Ct 值。

 

 

图4.采用自动化 Cells-to-CT™ 程序极大程度地减少了交叉污染。针对384孔平底培养板中的224份生物重复样本（2,500个 HeLa 细胞/孔），进行 HPRT1 实时 PCR，在这些样本之间穿插无细胞空白样本（160个孔，排列呈拼写“C2CT”）。所有空白孔（橙色孔）的 Ct 值为 >35，而样本的平均 Ct 值为 30.7 ± 0.5，表明孔之间未发生交叉污染。含细胞孔的 ΔCT（HPRT1–β-肌动蛋白）为 5.4 ± 0.4，这一低误差表明，整个培养板的 Ct 值差异是由于细胞数差异所致，而不是由于实时 PCR 变化所致。

结论

Cells-to-CT 程序的自动化可提高时间、人力和塑料制品利用效率，还能够获得与标准方法同等的极高质量的基因表达数据。

科学贡献者：
Ronald V. Abruzzese 和 Richard Fekete • Applied Biosystems