体外转录实用技巧
Lorianne Martin, M.S.

生成全长转录组

使用 Ambion 转录试剂盒合成的大多数 DNA 模板都可以生成全长转录组，无需任何优化。然而，一些模板可能产生过早终止的产物，如较小的离散带或拖尾/降解产物。对于印迹杂交，通常不需要全长RNA探针。然而，对于许多其他分析，至关重要的是转录进行到模板的末端，全部生成同一种大下的转录组（例如 NPA，体外翻译研究和结构分析）。转录反应失败或不良的两个最常见因素是标记核苷酸中的抑制剂和质量较差的DNA模板。应执行一系列简单的实验来确定转录反应失败的原因；随附的流程图概述了这一过程。以下列出了其他一些策略，用于增加有问题的转录反应中的全长产物比例。

增加限制性核苷酸的浓度
用最低浓度的标记核苷酸进行转录反应，可能由于核苷酸浓度不足而产生过早终止的转录组。增加限制性核苷酸的浓度通常会提高全长转录组的产量。

降低反应的孵育温度
通常，转录反应在室温或 37°C 下进行。将温度降低至约 16°C 或甚至 4°C 有时可以改善转录反应。人们认为，较低的反应温度会减慢聚合酶的进展，从而防止其被二级结构或一个特定核苷酸串置换。（想象一下玩具火车全速绕弯前行与缓慢绕同一条路线前行。）

使用不同的聚合酶
通常用于体外转录的三种RNA聚合酶可以相互不同地转录给定的模板。当转录不能完成时，可以充分利用这种转录给定模板序列的不同能力。改变转录模板前面的聚合酶启动子序列是一种劳动密集型修复，因为它可能需要设计PCR引物或亚克隆。Ambion 具有可简化过程的载体和引物。pTRIPLEscript 系列载体具有串联排列的 SP6、T7 和 T3 启动子，这些载体特别适用于亚克隆转录模板。或者，Ambion 的无克隆启动子添加试剂盒 Lig'nScribe 可用于改变可PCR扩增的DNA片段的启动子位点。

比活度 - 真实事例

比活度的测量单位为 cpm/µg；它反映了分子标记在放射性核苷酸上的比例。转录产物的比活度由反应中存在的标记核苷酸与未标记核苷酸的比例确定。高比活度探针比低比活度探针更灵敏。

在比活度和全长转录组产量之间进行取舍。
当转录反应涉及标记核苷酸时，该 NTP 浓度通常是反应中的限制性因素。如果“限制性核苷酸”的浓度太低，则 RNA 聚合酶可能不能生成全长转录组。用未标记形式的限制性核苷酸补充反应将增加转录组的产量和全长探针的比例，但会降低转录组的比活度。也就是说，每个分子的标记核苷酸将更少。当使用的最终限制性核苷酸浓度为 3µM 时，大多数转录反应将产生令人满意产量的相对高比活度转录本（例如 800 Ci / mmol 和 10 mCi/ml 时，5µl [-32P] UTP；20 µl 反应中为 12.5 µM）。

Ambion 的 CU Minusà 聚合酶启动子可以使用低至 1µl 最高比活度标记的 NTP 进行有效地工作。
如果某项分析需要尽可能大的灵敏度，CU Minus 启动子可减少在极低限制性核苷酸浓度条件下经常遇到的转录过早终止现象 - 产生比传统聚合酶启动子合成的高 7.5X 倍比活度的转录本。当限制性核苷酸浓度低至 0.165µM（相当于 1µl [-32P] UTP，3000 Ci / mmol 和 10 mCi/ml 条件下）时，CU Minus 启动子的转录可以完成。使用 Ambion 的 CU Minus 引物通过 PCR 反应将这些启动子整合到 pGEM´ 或 pBluescript´ 构建体中，或者将模板克隆到 Ambion 的专有 CU Minus 质粒载体 pDP18 和 pDP19 中。

通常不需要计算转录本的比活度。
检查放射性标记转录反应中标记核苷酸的掺入百分比始终是一个好主意；这是一种了解反应效果的简单方法。µ去除游离核苷酸之前和之后（通过旋转柱或 TCA 沉淀），闪烁计数等分反应试样，并进行比较（cpm/l）。如果将 40％ 或以上放射性标记核苷酸掺入至 RNA 中，则可能不需要计算产生的转录本的质量或反应产物的比活度。如果掺入量低于 40％，则反应或放射性标记核苷酸不是最佳的，并且可能需要谨慎地计算这些值和/或在凝胶上观察反应产物，以确保足够的全长探针可供分析使用。

RNA 探针合成故障诊断

 



pGEM 和 pBluescript 分别是 Promega 和 Stratagene 的注册商标。