揭秘DNase I

DNase I是一种多功能酶，可以非特异性地切割DNA，产生5'端为磷酸基团的二核苷酸、三核苷酸、或寡核苷酸 (1)。它是一种非常强大的DNA操作研究工具，可用于一系列分子生物学应用，包括：

1. 提取RNA后降解污染DNA
2. 在RT-PCR前或体外转录后纯化RNA
3. 识别与蛋白结合的DNA序列（DNase I足迹法）
4. 避免处理培养细胞时细胞聚集
5. 为DNA序列体外重组反应提供片段库

虽然实验室会经常用到DNase I，但很多研究者仍对DNase I的活性不甚了解。他们可能会有这样的提问：某种来源的DNase I与另一种的单位是一样的吗？钙离子与镁离子是保持DNase I活性所必需的吗？在DNA与RNA杂合链中，DNase I会不会降解DNA？DNase I能100%去除RNA样品中的污染DNA吗？本文将设法回答围绕这一常用酶的一些问题。

DNase I的比活性反映的是每单位酶降解双链DNA的能力。以往，比活性通常用库尼茨单位（Kunitz）表示 (2)，一个库尼茨单位是指以鲑鱼精子DNA为底物，在0.1M NaOAc (pH 5.0) 缓冲液的条件下，使反应液每分钟吸光度增加0.001所需要的酶量。然而这种缓冲液与DNase I消化时使用的典型缓冲液条件是不一样的（见右边的“使用DNase I处理RNA样品”）。Ambion则提供了一种更好的DNase I单位定义，该定义能更好地反映标准条件下DNase I所具有的降解DNA的能力。最新的DNase I活性测定程序使用实时荧光分析法，可以实现快速、定量的测量。

和许多其他的酶一样，DNase I活性也会受反应缓冲液成分的影响。与人们通常认知的不同，DNase I在含有Mg²⁺但不含Ca²⁺的缓冲液中没有活性 (3)。事实上，有文献证据表明在不含Ca²⁺的缓冲液中DNase I具有少量活性，是由钙离子污染造成的协同激活作用引起的。因此，在缓冲液中加入远小于Mg²⁺水平、但高于Ca²⁺水平的EGTA，可有效抑制DNase I活性1000倍甚至更多。众所周知，Ca²⁺可与DNase I紧密结合，使其活性结构稳定，甚至微摩尔水平的Ca²⁺也可在Mg²⁺存在的情况下有效激活酶的活性反应。

反映缓冲液的离子强度也是影响DNase I活性的一个因素。DNase I在缓冲液中含有Mg2+与Ca2+且不含其他盐的情况下具有最高活性。当标准反应缓冲液成分的盐（NaCl或KCl）浓度从0增加到30mM时，DNase I的活性会降低2倍多 (4)。虽然Ambion的MAXIscript™、MEGAscript™或其他转录缓冲液中也含有盐，但它们的DNA降解效果依然很好，因为含有远远超过降解DNA模板所需的DNase I量。关于建议的DNase I消化缓冲液信息，请查看侧边栏的“使用DNase I处理RNA样品”。

DNase I消化非匀质dsDNA时会得到60%的双核苷酸、25%的三核苷酸和一些寡核苷酸。DNase I最小可消化三个核苷酸的片段。虽然一般认为DNase I切割DNA时是非特异性的剪切，但实际上它更倾向作用于某些序列片段。例如，DNase I更容易作用于小沟区，也更倾向于剪切嘌呤-嘧啶序列。然而，DNase I在作用于非匀质dsDNA时会对四种碱基都进行剪切，且对于某种特定碱基的作用不会大于其它碱基3倍以上。

Ambion的技术服务部门经常会被问到DNase I是只能剪切双链DNA，还是同样可以降解单链DNA (ssDNA) 以及RNA-DNA 杂交中的DNA。DNase I能够剪切后两种底物，但活性大大低。例如，DNase I剪切ssDNA的比活性是剪切dsDNA的比活性的约500分之一 (4)，在RNA-DNA杂合链中的活性小于作用于dsDNA 时的活性1-2% (5)。特别要指出的是，在使用DNase I时，通常使用远高于所需的浓度值。例如，Ambion的实验显示，2个单位的Ambion DNase I（产品号 AM2222）孵育15分钟后，可以将1µg的100-mer寡核苷酸降解成小于5-mer的寡核苷酸。因此，切割ssDNA和RNA-DNA杂合链的程度会随着检测时的特定条件不同而不同。

DNase I较为常见的应用是在制备RNA过程中是通过降解残留的DNA来控制基因组DNA的量（低于10µg/ml），以免其影响后续的RT-PCR。一次DNase I反应所能处理的RNA量取决于DNA污染的程度。进行有机萃取，或使用固相RNA纯化方法时二氧化硅基体过载时，都可能引入DNA；而从某些组织（例如，脾、肾、胸腺）和或转染后的细胞中提取的RNA同样会倾向于存在更高水平的DNA污染。例如，有报告指出，使用Chomcynsk和Sacchi方法 (6) 提取肿瘤里的RNA会含有7%的DNA，若RNA制备达到一定规模时，DNA的量可以达到微克水平 (7)。

要完全去除RNA样品中的每一条DNA链几乎是不可能的。RT-PCR可以从复杂非匀质混合物中扩增单个分子；事实上，RT-PCR非常敏感，在进行40次以上PCR反应循环后，几乎每次反应都会在无逆转录对照反应中产生扩增条带，表明存在DNA污染。因此，选择最优的DNase I消化条件以及合理的RT-PCR循环数非常重要。为了最大程度地完全降解DNA，应使用侧边栏“使用DNase I处理RNA样品”中所述的缓冲液。此外，不要在RNA浓度过高时进行消化处理。应先将RNA样品稀释到~100 µg/ml以内后再进行处理。DNase I的用量取决于污染的程度。（相关指示请同样参考侧边栏说明）。

1. Vanecko, S and Laskowski, M (1961). J Biol Chem 236: 3312-3316.
2. Kunitz, M (1950) J. Gen Physiol 33: 349-362.
3. Moore, S (1981) Pancreatic DNase, in: The Enzymes (P.D. Boyer, Ed.) Academic Press, New York, Chapter 15.
4. Latham, G (Ambion, Inc.), unpublished data.
5. Sutton, DH, Conn, GL, Brown, T, and Lane, AN (1997) Biochem J 321 (Pt 2): 481-486.
6. Chomczynski, P, and Sacchi, N (1987) Anal Biochem 162: 156-159.
7. Kitlinska J, and Wojcierowski, J (1995) Anal Biochem 228: 170-172.