体外转录

体外转录反应需要纯化的含启动子的线性DNA模板、三磷酸核糖核苷酸、含DTT和镁离子的缓冲液体系，以及适当量的噬菌体RNA聚合酶。转录反应所需的具体条件取决于特定应用所需RNA的量。

兔网织红细胞裂解物
兔网织红细胞裂解物是一种高效的体外真核蛋白质合成系统，可用于外源性RNA（天然的或体外制备的）的翻译。网织红细胞是一种体内高度分化的细胞，主要负责合成血红蛋白（合成的蛋白质中，血红蛋白的比例超过90%）。这种未成熟红细胞已失去细胞核，但仍含有足够的mRNA以及全套翻译系统，可以合成大量球蛋白。内源性球蛋白mRNA可通过与依赖Ca2+的微球菌核酸酶一同孵育而除去，而之后可通过EGTA对Ca2+的螯合作用使核酸酶失活。Invitrogen提供核酸酶处理后的网织红细胞裂解物。这种裂解物是应用最广泛的依赖RNA的无细胞系统，因为其背景很低，且可高效利用低浓度的外源性RNA（图1）。外源蛋白质的合成速度与完整网织红细胞中所观察到的速度接近。

图 1.使用兔网织红细胞裂解物或小麦胚芽提取物进行的标准体外翻译流程。

未处理的网织红细胞裂解物可以对内源性球蛋白mRNA及外源性RNA分别或同时进行翻译。这类裂解物通常用于对翻译机制的研究，例如研究抑制剂对球蛋白翻译的影响。未处理的和经处理的兔网织红细胞裂解物均具有较低的核酸酶活性，并可用于大规模合成全长产物。此外，这两种裂解物均可用于带帽或无帽RNA（真核或病毒）的更大蛋白质的合成。

DNA模板必须包含噬菌体聚合酶结合并开始RNA合成所需的双链启动子区域。转录模板包括经克隆构建的质粒、基于RNA前体进行第一链及第二链合成（例如aRNA扩增）得到的cDNA模板，以及通过PCR方法或对化学合成的寡核苷酸进行退火所得到的线性模板等。

质粒
许多常用的质粒克隆载体均带有噬菌体聚合酶启动子。它们通常包含两个不同的启动子，在多克隆位点两侧各一个，从而可以对插入序列的任一条链进行转录。这类双重反向启动子载体包括pDP载体、Promega的pGEM载体、Stratagene的pBluescript载体以及Invitrogen的pCRII载体等。

pTRIPLEscript载体家族包含所有的三种噬菌体聚合酶启动子，它们前后排列（在多克隆位点的同一侧），从而可以适用于三种聚合酶（SP6、T7和T3）中的任意一种。

用作DNA转录模板的质粒载体需要通过限制性内切酶消化来线性化。因为转录反应会延续至DNA模板的末端，线性化可以确保获得确定长度及序列的RNA转录本。限制性内切位点无需是独一无二的，另外只要确保启动子与转录模板保持相邻，载体本身可以被多次酶切消化。另外在转录之前也无需将启动子插入序列从其他片段中纯化出来，因为只有包含启动子的片段才可以作为模板。限制性内切酶消化后应当进行纯化，因为酶切反应中的残留物可能会抑制转录反应。

PCR产物
PCR产物同样可以用作DNA转录模板。可以通过将启动子序列添加至上游或下游PCR引物的5’端从而将启动子添加至PCR产物中。这些序列通过PCR反应会形成双链启动子序列。

寡核苷酸
两条寡核苷酸也可用来构建短转录模板。将两条带有噬菌体启动子序列的互补寡核苷酸通过简单的退火反应即可形成双链DNA模板。事实上只需要使部分的DNA模板（RNA聚合酶启动子的-17到+1位碱基）形成双链即可。因此，只需合成一条短寡核苷酸和一条长链即可获得非对称杂交链（参见 "最小化序列需求")，成本更低。

cDNA
近来体外转录逐渐被应用于aRNA扩增反应。对于这类反应，可以在反转录过程中使用oligo(dT)-T7启动子引物，以RNA为起始材料获得转录模板。cDNA可以通过第二链合成反应转化为双链转录模板。

在设计转录模板时，必须确定需要的是正义链还是反义链转录本。若RNA是要用作与信使RNA杂交的探针（例如：Northern blot、原位杂交、核酸酶保护实验等），则需要互补的反义链转录本。反之，当进行表达、结构或功能研究时，或使用人工正义链RNA来构建RNA定量的标准曲线时，则需要正义链转录本。

DNA模板上的RNA聚合酶启动子序列+1 G是转录产物中的第一个碱基。为了获得正义RNA，编码链的5’末端应当与启动子的+1 G相连，或正好处于下游。若要转录反义RNA，则是非编码链的5’末端应当与+1 G相连。若插入片段是在载体中，则应当在启动子和需转录插入序列的下游对载体进行线性化（参见 "是否会得到反义链?").

体外转录反应可以划分为两种类型：常规反应和大规模反应。常规反应常用于合成放射性标记的RNA探针或将修饰核酸加入到转录本中，而大规模反应每次会获得>100 µg RNA，常用于结构和表达研究，以及aRNA扩增等。

常规反应：合成标记的RNA探针或修饰的转录本
MAXIscript™ 转录试剂盒等所使用的常规反应条件会使用相对较低的核苷酸浓度（每种仅0.5 mM）。更高的核苷酸浓度没有必要，因为在这类反应中，低浓度的放射性标记或修饰的核苷酸限制了反应的总产率。

限制性核苷酸（标记/修饰后的以及未标记的）的总浓度应当至少为3µM，从而可以对全长<400 nt的RNA转录本进行有效合成（若合成更长转录本则需更高浓度）。

通过添加5 µl的800 Ci/mmol、10 mCi/ml（或12.5 µM）的[α-32P] NTP溶液可以得到3 µM浓度的放射性标记rNTP。更高特异性活性的标记rNTP也是可以获得的，但是摩尔浓度通常会更低（例如，3000 Ci/mmol、10 mCi/ml的保存浓度仅为3.3 µM）。如果不添加未标记NTP，终浓度将无法达到3 µM这一最低要求。

因为起限制作用的核苷酸会导致转录提前终止，所以需要在高特异活性转录本（或大量修饰转录本）和全长转录本的合成之间进行平衡。使用未标记核苷酸来稀释放射性标记或修饰核苷酸会降低转录本的特异活性（或修饰程度），但会获得更多的全长转录本。要获得具有极高特异活性或很大程度上得到修饰的转录本，需要对所使用的未标记限制核苷酸进行进一步限制或去除。

当使用转录起始位点下游12个碱基范围内缺乏CTP和TTP的模板进行RNA转录时，起限制作用的核苷酸可以不用满足最低3 µM的浓度要求 (1)。Ambion的无CU启动子技术提供了带有不含CTP和TTP的RNA聚合酶启动子的载体，以及可用于在已有载体上去除RNA聚合酶启动子区域的CTP和TTP碱基的转换引物。这种模板可以在低至0.165 µM的总限制核苷酸的反应中提供更高比例的全长转录本。使用无CU技术，可通过不添加未标记的核苷酸的体外转录反应获得具有最高特异活性的放射标记核苷酸。因此，可以获得特异性提高7.5倍的RNA探针。

大规模合成：用于结构及表达研究，以及aRNA扩增等
在20 µl反应体系中，大规模体外转录反应通过每微克模板可以获得最多120-180 µg的RNA。由Ambion开发的全新专利技术（例如MEGAscript™，参见下文）可以使噬菌体RNA聚合酶在高核苷酸浓度环境中保持活性，而在过去这种环境通常会对酶产生抑制作用。这类大规模反应的得率通常比常规转录反应高10到50倍（没有任何限制性核苷酸）。反应条件（例如核苷酸盐的类型，转录缓冲液中盐的类型和浓度，酶的浓度以及pH等）不仅需要针对每种聚合酶，还需针对所有成分进行优化。只有这样才能获得最优的得率。

Invitrogen提供一整套用于体外转录的产品。其中，MAXIscript转录试剂盒非常适于制备用于杂交反应的放射性及非同位素标记的RNA探针。由Strip-EZ RNA Probe Synthesis and Removal Kit制得的探针可以在Northern blot中轻松去除，从而可以进行多轮杂交而无需破坏与膜结合的核酸。

MEGAscript试剂盒家族使用了Ambion的高得率专利技术，可满足对RNA用量要求较高的应用。mMESSAGE mMACHINE 转录试剂盒 使用了相同的高得率专利技术，可以合成大量加帽RNA转录本。如有需要， 多聚腺苷酸加尾试剂盒可用于在mMESSAGE mMACHINE 转录试剂盒合成的加帽RNA转录本的3‘端添加poly(A)尾。

MessageAmp™ aRNA Kit 是基于专利的Eberwine方法来进行aRNA扩增的完整试剂盒。该试剂盒结合了MEGAscript高得率转录技术，包含了第一链cDNA合成、RNase H消化、第二链合成、cDNA纯化、体外转录及aRNA纯化所需的需要的所有试剂。

1. Ling M-L, Risman SS, Klement JF, McGraw N, McAllister WT.噬菌体T3及T7聚合酶在限制底物条件下的反应起始失败。Nucl. Acids Res. (1989) 17: 1605-1618.