基础知识: RT-PCR

近年来, 全新实验原理和仪器平台的发展使 PCR的相关产品达到了实时检测的水平，由此研究人员已开始广泛采用实时RT-PCR技术作为定量检测基因表达改变的首选方法。此外，实时PCR已经成为芯片分析或其它高通量基因表达研究结果验证的首选方法.

为充分理解实时PCR的优势，我们有必要对PCR技术的基本原理进行一次回顾。在PCR反应的起始阶段，体系内的试剂均为过量，形成退火的模板和产物都处于足够低的水平，因此不会竞争引物的结合作用，所以扩增过程此时以稳定的指数比率进行着。由指数增长期转入线性期的扩增反应速率拐点具有很大变数，即使对于重复样本也是如此，这主要是由于PCR产物的复性对引物结合形成了竞争作用所导致的（因为即使加入更多试剂或酶，也不会有多大改善）。在某些后期的循环中，扩增效率降至零附近（平台期），此时基本不再有新的产物生成了.

出于准确性和精确度方面的考虑，有必要在每一样本都处于指数扩增期的时间节点收集定量数据（因为只有这一阶段扩增的重复性最好）。在指数期阶段内，针对某一特定循环数时的反应进行分析，理论上对底物初始浓度的检测能够达到几个数量级的动态检测范围。此时，丰度低的靶基因可能尚低于检测下限，而丰度高的靶基因扩增反应则可能已经超出指数期了。在实际操作当中，终点法相对定量RT-PCR能够对2-3个数量级动态范围的靶基因进行定量。为了拓展检测范围，可反复调整反应的循环数（更多或更少），以达到在指数期分析所有样本的目的。.

实时PCR技术通过在每一循环中定量各个样品的反应产物，从而将费力的操作变得自动化。所检出的结果能够达到惊人的10⁷倍动态范围，而且无需用户反复手动调整反应循环数以保证扩增反应在指数期内。包括生成标准曲线和计算拷贝数等操作在内的数据分析过程均可自动完成。随着越来越多的实验室与核心设施平台开始购买实时分析设备，本技术也正在成为基于RT-PCR的主流定量技术。.

目前的实时PCR主要有四种不同的检测方法可选：TaqMan（Applied Biosystems，美国加州福斯特城）、Molecular Beacons（分子信标）、Scorpions 和SYBR Green（Molecular Probes）。所有这些检测方法都能够通过生成荧光信号来检测PCR产物。TaqMan探针、Molecular Beacons和Scorpions的产品都基于荧光共振能量转移（FRET）的原理，即通过在相同或不同寡核苷酸底物上结合荧光染料分子与淬灭基团，形成偶联作用来制造荧光信号。SYBR Green为在溶液中本身几乎不发光的荧光染料，一旦结合双链DNA即会发出强烈的荧光信号。.

TaqMan探针

TaqMan探针基于PCR所使用 DNA聚合酶的5'端核酸酶活性来水解与靶标扩增子相结合的探针。TaqMan探针是一段寡聚核苷酸，5'端连有荧光报告染料，3'端结合有荧光淬灭基团。这些探针经过特殊设计，专门针对PCR产物的内部区段进行杂交。在未发生杂交的状态下，荧光和淬灭分子之间距离很近，因此不能检出探针上的荧光信号。在PCR过程中，DNA聚合酶TaqMan探针所结合的模板5'端外切酶活性将剪切该探针进而导致荧光和淬灭基团之间的解离，FRET效应不复存在。因此，荧光会在每一循环中逐渐增强，信号不断升高的程度与探针被剪切的量成正比 。

设计精良的TaqMan探针几乎不需要使用条件方面的优化。此外，通过在每一探针上偶联具有特定光谱的荧光/淬灭配对分子，即可实现多重检测。不过，TaqMan探针的合成比较昂贵，需针对每一mRNA靶点单独合成探针。

分子信标

与TaqMan探针类似，Molecular Beacons（分子信标）也使用FRET技术来检测和定量新合成的PCR产物，其寡聚核苷酸底物的5'端同样结合了荧光基团，3'端附有淬灭基团。不同于TaqMan探针的是，Molecular Beacons产品的设计是在扩增反应中仍保留其完整性，，在每一循环中都需与靶点重新结合以进行信号检测。Molecular Beacons在溶液中以茎环结构的形式存在,此时荧光与淬灭分子紧密靠近，阻止探针发出荧光。当Molecular Beacons与靶点发生退火时，荧光染料和淬灭基团会发生分离，FRET效应消失，荧光染料随即发出荧光。

Molecular Beacons与TaqMan探针类似，也可通过在每一探针上结合彼此光谱分离的荧光/淬灭基团来实现多重分析。Molecular Beacons的合成比较昂贵，需为每一靶基因单独订制探针，这点也与TaqMan探针比较相似。.

Scorpions

使用Scorpions探针，序列特异性的引物起始与PCR产物的检测可通过一条寡聚核苷酸来实现。处于未杂交状态的Scorpion探针也为茎环结构。其5'末端附着的荧光基团被3'末端偶联淬灭基团所淬灭。茎干部分的3'端还含有引物延伸产物的互补序列。这一序列将与特定引物的'端序列相结合，形成不可再参与扩增的单体形式。在Scorpion引物发生延伸后，特定的探针序列即可结合已延伸的扩增子区域的互补序列，从而打开茎环结构。这一过程去除了淬灭效应，荧光信号得以检测。.

SYBR Green

SYBR Green 为在反应中实时检测和定量PCR产物提供了最为简单和经济的方式。SYBR Green能够结合双链DNA分子，随即可被激发出荧光。因此，当PCR产物聚集时，荧光信号也随之增加。SYBR Green的优势在于其经济性、易用性和灵敏性。缺点在于SYBR Green会结合反应中任何形式的双链DNA，这其中包括引物二聚体及其它非特异性的反应产物，从而导致用户对靶标浓度的过高估计。对于良好设计的引物和单一产物的PCR反应而言，SYBR Green可以工作得非常好，非特异性的假背景信号只会在很晚的循环中出现.

YBR Green是实时PCR检测技术中最经济的选择。染料是与双链DNA相结合，因此无需为任何特定靶点专门设计探针。不过，SYBR Green检测法需要进行较多的条件优化工作。由于染料无法区分PCR反应过程中所累积的特异性和非特异性的产物，因此还需对其结果进行验证分析.

多重PCR的实时报告分子

由于可在不同的探针上偶联不同发射光谱的荧光染料，TaqMan探针、Molecular Beacons和Scorpions技术都允许在同一样本中检测多个DNA靶点（多重PCR）。多重PCR中可设置同步扩增的PCR内参，以及在单管体系中实现等位基因的区分。这些杂交探针可达到SYBR Green法无法实现的分辨水平，因为在单一PCR反应中它们只会与特定的靶点退火，而不与引物二聚体或其它非特异性产物结合.

通常使用两种策略来定量实时RT-PCR所检出的结果：标准曲线法和阈值比较（comparative threshold）法。下面对此两种方法进行阐述。.

标准曲线法

在本方法中，首先基于已知浓度的RNA样本建立标准曲线。这一曲线随后作为参考标准，被用于推测未知浓度的mRNA的定量信息。尽管使用了RNA标准品，不过在最后的分析结果中，这些标准品的稳定性仍是结果变异度的一个来源。此外，使用RNA标准品可能涉及到构建cDNA质粒，并将其体外转录为RNA标准品，并进行精确定量，这是一个耗时的过程。不过，使用绝对定量的RNA标准品将有助于获得绝对拷贝数的相关信息.

除RNA样品以外，纯化的质粒dsDNA、体外合成的ssDNA，或任何表达靶基因的cDNA样本等各类核酸样本也均可用于标准曲线的建立。可通过260nm波长处的分光光度值来估算这些DNA样品的浓度，并基于样品分子量将其换算为拷贝数。cDNA质粒是进行标准曲线法定量的首选标准品。不过，由于cDNA质粒无法为反转录效率上的变异度提供参照，本法仅能提供mRNA表达改变的相对信息。以上限制，以及由于RNA样品用量的差异所引起的变异度，均可通过针对看家基因的均一化进行校正.

Ct值比较法

另一种定量方法称为Ct值比较（comparative Ct）法。该方法将目的样品与对照样品或校准样品（如未处理组样本或正常组织RNA）的Ct值进行比较。校准样品与目的样品的Ct值都相对一个适当的内源看家基因进行均一化运算.

Ct值比较法也称为2^{–[Δ][Δ]Ct}方法，在此

ΔΔCt = [Δ]Ct（样品组）- [Δ]Ct（对照组 ）

这里，ΔCT,（样品组）表示样品组内目的基因减去内源看家基因的Ct值的差值，ΔCt,（对照组）则表示 对照组内目的基因减去内源看家基因的Ct值的差值.

为了验证为了保证 [Δ][Δ]Ct的计算结果准确，靶基因与内参的扩增效率应比较一致。这些样品的扩增效率可通过观察[Δ]Ct随样品稀释如何改变如何而进行评估。如果cDNA的稀释度对ΔCt作图，斜率接近于零，则意味着靶基因和看家基因的扩增效率十分相似。如果没有扩增效率与目的基因相近的看家基因（的检测信号），则请优先选择标准曲线法.

实时PCR是由 热循环仪, 计算机,荧光激发与信号采集的光学系统, 以及数据获取与分析软件所组成的设备平台.由数家制造商提供的相关仪器，在样本容量（一些为96孔板的标准形式，另一些处理的样本数较少或需要专用的玻璃毛细管）、激发方法（一些使用激光、另一些使用宽谱光源和可调滤镜）以及整体灵敏度等方面均存在差异。不同平台在软件数据加工方面也各有特点。实时PCR仪的成本并不低，目前在2万5千至9万5千美元左右，而对于有高通量定量分析需求的核心平台或实验室而言，这些产品都是在他们的采购范围之内的。如需浏览实时热循环仪的完整列表，请参阅本文结尾处的网络链接.

Ambion的 MessageSensor™ RT试剂盒 包含了一种RNase H+的 MMLV反转录酶，该酶在实时RT-PCR实验中的性能要超过突变缺失了RNase H活性的MMLV反转录酶。不同于其它各类qRT-PCR试剂盒，MessageSensor包含了总RNA对照，人类GAPDH对照的引物对，RNase抑制剂、核苷酸，以及用于SYBR Green染料法检测的缓冲液添加剂.

Cells-to-cDNA™ II型试剂盒 能够在短于2小时的时间里，从培养的哺乳动物细胞获取cDNA。无需RNA分离步骤。当客户需要对少量细胞，或者大量细胞样本执行反转录操作，或客户不熟悉RNA分离步骤，该产品是理想选择。Ambion的Cells-to-cDNA II型试剂盒包含了全新的细胞裂解缓冲液，能够抑制内源的RNase活性，而不会影响后续反应中的的酶学反应。在RNase被灭活之后，细胞裂解产物可直接用于cDNA的合成反应。Cells-to-cDNA II型试剂盒可兼容一步法或两步法的实时RT-PCR方案。.

基因组DNA污染会导致RT-PCR产生假阳性的结果。Ambion为减少RT-PCR之前RNA样本中的基因组DNA污染提供了多种工具。Ambion的 DNA-free™ DNA酶处理和清除试剂 专为去除RNA样本中的DNA污染而设计，并可于处理完成之后方便地清除DNA酶，从而免除了蛋白酶K处理和有机萃取步骤。此外，Ambion还研发了 TURBO™ DNA酶, 一种由牛的野生型DNA酶改造而来的高活性DNA酶。TURBO DNA酶可有效结合极低浓度的DNA，这意味着本品能够特别高效地清除痕量的DNA污染.

目前ABI 7700及其它基于0.2 ml反应管的实时设备往往使用昂贵的PCR试剂，Ambion也为此类应用提供了经济的替代产品。SuperTaqTM Real-Time包含了dNTP，以及专为SYBR Green、TaqMan与Molecular Beacon检测方法进行优化过的反应缓冲液，使用效果等同甚至优于那些更为昂贵的试剂.

尽管实时PCR检测的化学原理和仪器领域拥有快速的优势，终点法RT-PCR仍是在少量样本中检测基因表达变化的最常用技术.

终点法RT-PCR通过三种不同的方法进行基因表达水平改变的检测：相对法、竞争法与比较法。对终点法RT-PCR结果进行定量的最常用方法是对溴化乙锭（EB）等荧光染料进行检测，或通过磷光成像仪或闪烁计数（较少用）来定量P32标记的PCR产物.

相对定量法使用同步扩增的内参进行样本数据的均一化计算，以在多个样本之间比较转录本的丰度。所得结果为基因特异性信号相对于内参信号的比值。这将得到每一样本中基因特异产物的经过均一化校正过的相对值。用户可在样本之间比较这些结果值，来评估样本中靶标RNA的相对表达情况；举例来说，2号样本中的IL-12表达水平比1号样本高2.5倍.

竞争性RT-PCR是为样本中的特异性mRNA序列实施绝对定量（例如 5.3 x 10⁵拷贝）的检测方法。向RNA重复样品副本中加入合成的RNA（序列几乎相同，仅仅是略短于内源性靶点）的稀释物，并与内源的靶点在单个反应中进行同步扩增。之后将内源转录本的PCR产物与合成的竞争者所创建的浓度曲线进行比较."

比较RT-PCR模拟了竞争性RT-PCR的特点，即在单个反应中，每一RNA样本的靶基因都会竞争扩增试剂，从而获得可靠的定量结果。由于两份样本的cDNA具有相同的PCR引物结合位点，一份样本即成为另一份的竞争者，这样就无需另外合成竞争RNA序列.

相对RT-PCR和竞争性RT-PCR这两种定量技术均需要预实验来摸条件。对于相对RT-PCR而言，预实验的目的是选取合适定量方法，并确定每一mRNA的指数扩增范围。对于竞争性RT-PCR来说，必须合成RNA竞争者转录本，并在预实验中确定其扩增标准曲线的适当区间。比较RT-PCR能够达到相对和竞争性RT-PCR的相似灵敏度，但所需条件优化操作要少得多，并无需合成竞争序列.

相对RT-PCR在同一RT-PCR反应中，使用内参引物与基因特异性引物进行多重扩增。内参和基因特异性引物必须相互兼容——即它们不会生成额外的扩增条带，也不会发生相互杂交。内参还需在所分析的全部样本中具有一致的表达水平。满足以上条件之后，内参信号即可用于样品数据的均一化处理，以消除由于RNA质量差异、反转录效率、不精确的样品定量及加样操作所导致管与管之间的差异。常用的内参包括ß-actin、GAPDH mRNAs，以及18s rRNA。不同于Northern与核酸酶保护分析等方法中向实验系统简单加入内参探针的操作，相对RT-PCR技术的内参需要较多的条件优化.

为了获得有意义的相对RT-PCR数据，PCR反应必须在内参和目的基因产物均处于可被检测的指数扩增期时终止（参见确定PCR扩增的指数范围部分）。由于内参RNA通常为高丰度组成性表达的管家基因，它们的扩增可能在很低的循环数跑出指数增长期。当目的PCR产物源自丰度很低的信使RNA时，上述情况会导致很难选取两者共有的指数增长期。因此在这种情况下不推荐使用如溴化乙锭（EB）染色一类的低灵敏度检测法染色等低灵敏度检测法。当内参信使RNA丰度很高时，可通过几种方法检测处于指数扩增期的稀有mRNA：1）通过增加产物检测方法的灵敏度，2）通过减少RT反应或PCR反应中的样品输入量和反应中的模板用量和/或3）降低PCR循环数.

Ambion推荐使用18S rRNA作为内参，因为它在不同的处理条件下显示出优于ß-actin与GAPDH的表达稳定性。不过，由于18S rRNA的表达丰度很高，因此在18S rRNA的指数扩增期，比较难检测到稀有信使RNA的PCR产物。Ambion的CompetimerTM专利技术通过将18S rRNA的信号降低至稀有信使RNA同等的水平，来解决此类问题。使用competimer获得弱化的扩增结果——该引物序列与功能性18S rRNA引物相同，但由于其3'端被阻断，因此无法通过PCR进行延伸。以不同比率混合Competimer和引物，从而减少18S rRNA的PCR产物量。图1说明了由于18S rRNA的扩增淹没了Clathrin的目的条带（比较A图与B图），因此不含Competimer的18S rRNA无法用做内参。将引物与Competimer以3:7的比例混合，能够削弱18S rRNA的信号，此时18S rRNA成为可用内参（图C）.

图1.Ambion在多重定量RT-PCR中使用的QuantumRNATM技术,以18S rRNA作为内参.

使用A）网格蛋白的引物，B）网格蛋白与18S的引物，或C）网格蛋白、18S rRNA引物和18S rRNA Competimer，对脑部、胚胎、肝脏和脾脏总RNA样本进行RT-PCR反应。请注意在不含Competimer的条件下，18S由于丰度过高而无法用做内参（B）。Competimer的加入（C）使得多重PCR顺利达成，从而实现了样本之间的相对定量.

Ambion的 QuantumRNA 18S 内参标准品（QuantumRNA 18S Internal Standards） 包含了18S rRNA引物和competimer，该产品专为所有真核生物的18S扩增操作而设计。通用型18S内参标准品（Universal 18S Internal Standards）可适用于植物、动物和多种原生动物等广泛的生物体样本。经典（Classic）I型和II型18S内参标准品适用于任何脊椎动物的RNA样本。所有的18S内参标准品均可用于多重RT-PCR。这些试剂盒也包含了RNA对照和说明手册（Instruction Manual），详细介绍了优化相对RT-PCR数据的一系列实验方法。对于已验证需要使用ß-actin做为内参的研究，可选用 QuantumRNA ß-actin内参标准品（QuantumRNA ß-actin Internal Standards）.

竞争性RT-PCR技术通过将RT-PCR产物信号的强度与合成的竞争性RNA序列所生成浓度曲线进行比较，来实现信使RNA的精确定量。竞争性RNA转录本专门针对内源靶点设计了相同的引物序列，以达到相同的扩增效率。竞争性RNA会生成大小不同的PCR产物，通过凝胶分析可以将其与内源靶点的产物区分开来。竞争性RNA被精确定量并将其系列稀释后加入RNA重复样本中。通过预实验找到信号强度最为相似的竞争性RNA的浓度范围。最后，将实验样本的产物量与标准曲线相比较，以确定样本中特定RNA的含量.

某些实验方案会在竞争性RT-PCR实验中使用DNA竞争序列或随机序列。不过，这些竞争序列不同于RNA竞争序列，不能作为反转录实验中的变异度或特定目的条带序列扩增效率的有效参考.

尽管异常灵敏，但相对定量RT-PCR与竞争性定量RT-PCR均有弱点。相对RT-PCR需要大量的条件优化工作，以确保PCR在目的基因和内参都处于指数扩增期时终止反应。竞争性RT-PCR需要为每一靶标合成外源竞争序列。而比较RT-PCR法能够达到标准qRT-PCR方法的灵敏度水平，但其所需的条件优化工作明显减少。同时分析两份样品中的靶标mRNA，每一份样品都做为另一份的竞争者，这样就可在样品之间比较靶基因的相对丰度。对于通过芯片分析和差异展示等筛选技术所发现的靶标基因而言，比较RT-PCR是实施分析的理想方法.

当您在实时RT-PCR、的相对RT-PCR、竞争性RT-PCR或比较RT-PCR技术之间进行选择的同时，Ambion为您准备了简化RT-PCR实验和更精确定量数据的相关产品。除上述专用产品外，Ambion还提供SuperTaq™聚合酶, M-MLV反转录酶, 以及无RNase的PCR管.为避免PCR实验中的交叉污染，Ambion也提供了 DNAZap™ DNA降解溶液以及无RNase的带滤芯的枪头.

如需获得涵盖实时RT-PCR技术方方面面内容的完整文献列表，请访问 www.wzw.tum.de/gene-quantification/real-time.html