神经干细胞特异性蛋白表达和线粒体评估

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帕金森病 (PD) 是一种进行性神经退行性疾病，影响全球 1% 的60岁以上人群且影响人数超过500万人 [1]。PD 是由于大脑黑质区域多巴胺能神经元的选择性丢失所致。这些神经元丢失最初会影响运动。但是，随着疾病的进展，认知功能会受到损害，晚期疾病常伴有痴呆。缺乏 PD 的生理相关细胞模型是 PD 研究的主要瓶颈。开发合适的 PD 模型不仅能够加速疾病机制和药物靶点的发现，还能够在临床和治疗策略的筛选中发挥关键作用。

源于患者特异性 iPSC（诱导多能干细胞）的细胞类型已成为极具吸引力的体外疾病建模工具。我们与帕金森病研究所（加利福尼亚州森尼韦尔）的研究合作已开始使用由 iPSC（源于该研究所收集的患病成纤维细胞）衍生的神经干细胞 (NSC) 开发 PD 模型系统。NSC 是一种具有自我更新能力的多能祖细胞，可分化为神经元。本文中，我们介绍了两种用于评估 NSC 特性和健康状况的检测试剂盒：人神经干细胞免疫细胞化学试剂盒提供可对人 NSC 的4种常见标志物进行便捷图像分析的试剂和实验方案，MitoSOX Red 线粒体超氧化物指示剂提供了一种可测量细胞中线粒体超氧化物水平的简单方法。这些检测试剂盒用于评估在开发针对 PD 研究的神经退行性疾病细胞模型作为一个步骤生成的 NSC。

检测 NSC 特异性蛋白表达

作为 PD 疾病模型，评估 NSC 的第一步是确认其细胞类型。四种成熟的蛋白标志物（巢蛋白、Sox1、Sox2 和 Pax6）的表达是 NSC 特性和质量的基本指标。我们评估了六个不同患者来源细胞系的 NSC 特异性蛋白表达。将来自三名受 PD 影响供体（PD-1、PD-2 和 PD-3）、一名受多系统萎缩 (MSA) 影响供体和两名年龄匹配的健康对照个体的疾病特异性成纤维细胞重编程为 iPSC 细胞系。来自三名 PD 供体的成纤维细胞先前已经过基因分型，已知在基因 LRRK2、GBA 和 PARK2 中含有常见的 PD 相关突变，而 MSA 细胞系来自一个散发病例，在已知与 PD 相关的基因中没有突变。MSA 已被描述为更严重的 PD 形式，其特征是在第一次出现症状后疾病进展更快 [2]。

经分析确认6个 iPSC 系已成功重编程后，使用 Gibco PSC 神经诱导培养基将其分化为 NSC。PSC 神经诱导培养基提供了一种在7天内从 iPSC 产生 NSC 的方法，无需形成拟胚体 (EB) [3]。利用人神经干细胞免疫细胞化学试剂盒，我们证明了所有6种 NSC 系都表达了已知的神经蛋白标志物巢蛋白、Sox1、Sox2 和 Pax6（图1）。人 NSC 免疫细胞化学试剂盒包括一套优化的一抗和二抗、蓝色荧光核酸染料 DAPI 以及完成染色方案所需的所有缓冲液。

显示对受 MSA 和 PD 影响供体产生的 NSC 上的 NSC 特异性标志物进行免疫细胞化学检测的多组图像

图1.对受 MSA 和 PD 影响供体产生的 NSC 上的 NSC 特异性标志物进行的免疫细胞化学检测。将 NSC（第3代）在 Geltrex 基质包被腔室玻片上的神经扩增培养基（50% Neurobasal 培养基、50% Advanced DMEM/F-12 和 1X Gibco 神经诱导添加剂）中培养2天。在 15 分钟的固定步骤后，将细胞透化处理 15 min，封闭 1 h，然后与巢蛋白（绿色）、Sox2（红色）、Sox1（绿色）和 Pax6（红色）的抗体一起孵育，并使用 DAPI 核酸染料（蓝色）复染；所有试剂均在人神经干细胞免疫细胞化学试剂盒中提供。使用 EVOS FLoid 细胞成像工作站采集图像。六种 NSC 细胞系对标志物巢蛋白、Sox2、Sox1 和一定水平的 Pax6 染色呈阳性；此处显示了 MSA NSC 和 PD-3 NSC 的代表性图像。

监测线粒体活性作为一项细胞健康指标

在评估药物、环境因素和生物调节剂的细胞效应时，NSC 健康是一项重要的监测参数。无法使用单一生理属性轻易定义细胞健康，因此通常需要使用多种不同的细胞功能指数。因此，对衍生的 NSC 进行了扩增，并用一组对指示神经细胞健康特别有用的检测试剂盒对其进行了检测，因为每种检测试剂盒可测量细胞活力的不同方面。

使用的细胞功能探针之一是 MitoSOX Red 线粒体超氧化物指示剂，该指示剂会随着线粒体超氧化物水平的增加而显示出红色荧光增加，并且可以在荧光酶标仪上轻松检测到。NSC 的特征是具有依赖于稳健线粒体功能的高代谢活性。为评估它们的线粒体活性，我们使用三种不同的细胞应激源（鱼藤酮、缬氨霉素和叔丁基过氧化氢 (TBHP)）对 NSC 进行了处理，作用分别为抑制电子传递链、破坏跨膜浓度梯度和诱导氧化应激。在这项研究合作中开发的全部六种 NSC 细胞系都表现出对这些细胞应激源的预期线粒体反应（图2）。

显示 PD-3 NSC 中氧化应激检测结果的折线图


图2.利用 MitoSOX Red 线粒体超氧化物指示剂检测 PD-3 NSC 中的氧化应激。在 CTS CELLstart 底物包被的384孔检测板中，于 37°C 下将 PD-3 NSC 在 StemPro NSC SFM 中培养 24 h。与 5 µM MitoSOX Red 线粒体超氧化物指示剂孵育 1 h 后，用生长培养基洗涤细胞一次，然后用应激源化合物处理 2 h，并在 Tecan Safire2 荧光酶标仪上测定所得荧光。随着鱼藤酮、缬氨霉素或叔丁基过氧化氢 (TBHP) 浓度的增加，PD-3 NSC 显示出预期的氧化应激增加。

参考文献

  1. Olanow CW, Stern MB, Sethi K (2009) Neurology 72:S1–S136.
  2. Burn DJ, Jaros E (2001) Mol Pathol 54:419–426.
  3. Yan Y, Shin S, Jha BS et al.(2013) Stem Cells Transl Med 2:862–870.

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