多色流式细胞术配色需使用合适的荧光染料

（参见本文中的产品列表。）

流式细胞分析试剂和仪器的进步，使得研究人员能够开展日益复杂的多色实验。 多色流式细胞术的优势在于能够使用多个标记物进行单细胞研究，能够使用多个分析物使细胞数据相关联，并最终获得更准确界定的细胞群体（图1）。 此外，多色流式细胞术实验可通过减少样品和样品体积需求量并提高样品通量，进而提高效率。 注意，尽管增加颜色和检测抗原的数量可提高实验设计的复杂度，但这需要对优化、对照和其他细节进行格外要求[1]。

对于多色流式细胞术，其中最大的一项挑战就是流式配色，选择合适的荧光染料和抗体组合，从而最大限度减少对补偿和重叠调整的需求，同时保证数据质量和准确度不受影响。  

在多色流式细胞术的流式配色时，应考虑以下几个关键要素：

  • 提前了解所用仪器的配置（激光和滤光片）。
  • 使用如荧光光谱查看器等相关工具，查看荧光染料的光谱重叠。
  • 滴定和优化每种抗体；流式Panel需反复优化，以构建正确的方案。
  • 对低丰度抗原使用明亮的荧光染料标记抗体，对高表达抗原使用弱的荧光染料标记抗体。
  • 使用对不同细胞亚群具有光谱相似性的荧光染料，这些不同的细胞亚群将分别设门和分析。
  • 多色Panel应包含细胞活性染料，用于从数据中排除死细胞和残骸。

图 1. 使用Attune NxT声波聚焦流式细胞仪对人外周血单核细胞（PBMC）进行10色免疫分型。 根据前向散射和侧向散射图为淋巴细胞和单细胞设门 (A)。 在淋巴细胞门内，可根据CD3的表达分离T细胞 (B)，并进一步将其细分为CD4+和CD8+亚群 (C)。 此外，调节性T细胞可表达CD4和CD25 (G)，是主要外周耐受的重要媒介。 根据CD62L的表达可区分初始CD4+和CD8+ T细胞（TN），而HLA-DR由活化T细胞（TA） (D,H)表达。 常规突状细胞存在于外周血中，通常对T和B细胞谱系标记呈阴性，并且共同表达整合素CD11c和HLA-DR (F)。 在散射图中，单核细胞恰好位于淋巴细胞上方 (A)，并且表达CD14和CD33 (E)。

确定荧光染料亮度

在流式细胞术分析中，荧光染料亮度不仅受荧光染料本身量子产率和消光系数的影响，也受背景亮度的影响。 背景荧光，例如来自于非特异性染色、细胞自体荧光和仪器噪音等的背景荧光，可影响对抗体偶联染色细胞群体（阳性）和未染色细胞群体（阴性）的荧光的分辨能力。

信噪比（S/N）是衡量测定的灵敏度以及测定对染色和未染色群体差异的检测能力的一个指标； 可通过采用阳性细胞的中值荧光强度（MFI）除以阴性细胞的中值荧光强度（图2），进行简单计算。

但是，荧光染料抗体的相对亮度不仅由染色与未染色细胞的强度差异决定，还由未染色细胞群体的强度分布扩散程度决定。 Maecker等人认为 [2]，计算染色指数（SI）时应将这两种参数包含在内（图2）。 染色指数（SI）可用于对比使用相同抗体的不同荧光偶联物染色的细胞群体的柱状图（表1，图3）。

图 2. 染色指数（SI）和信噪比（S/N）的比较。 图中两种荧光染料的信噪比（S/N）相同，但染色指数（SI）不同，这是因为它们具有不同宽度的负峰（窄W1和宽W2）。 负峰的宽度可影响阳性和阴性信号的分离，因此，染色指数（SI）是对比荧光染料亮度的首选统计指标。

表 1. CD4抗体（克隆53.5）的不同荧光染料染色指数。

亮度荧光染料
激发波峰波长*发射波峰波长*激光器发射带通滤光片（BP Em filter）†染色指数
高APC645660633660/20200.31
PE496, 565575488585/42158.46
APC-Cy5.5  650690633710/50108.97
PE-Cy5.5  496, 565690488695/40105.91
Alexa Fluor 488染料495519488525/5091.72
中等PE–Alexa Fluor 610染料488628488620/1070.71
FITC 染料493525488525/5056.40
PE-Cy7496, 565774488780/6053.70
PE–Alexa Fluor 700染料496, 565723488720/3052.45
TRI-COLOR染料(PE-Cy5)496, 565670488695/4050.31
PE–Texas Red染料496, 565613488695/4040.85
Qdot 605 纳米晶体350605405605/2035.17
APC–Alexa Fluor 750 染料645775633780/6031.91
Alexa Fluor 700 染料696719633710/5024.85
低Qdot 655 纳米晶体350655405655/2020.62
Qdot 705纳米晶体350720405720/2018.38
Pacific Blue 染料410455405450/5014.61
Alexa Fluor 405染料401421405450/5010.01
PerCP482675488695/408.75
Pacific Orange 染料400551405585/426.06
*偶联物的近似最大荧光激发(Ex)和发射(Em)波长，单位为nm。 †BP Em filter =带通发射滤光片，单位为nm。 使用BD™ LSR II流式细胞仪和FACSDiva™ 软件6.1版确定染色指数。

图 3. CD4抗体偶联物染色细胞的代表性柱状图。 使用由氯化铵裂解的人全血样品评估20种不同小鼠抗人CD4抗体直接偶联物的性能（见表1）。 对每种偶联物进行滴定和优化，以获得最大信噪比。 使用BD™ LSR II流式细胞仪和FACSDiva™ 软件6.1版分析细胞。 柱状图代表在淋巴细胞门中收集的10,000个细胞： (A) 来自于 CD4抗体-APC偶联物的高亮度；(B) 来自于 CD4抗体- PE–Alexa Fluor 700偶联物的中等亮度；(C) 来自于 CD4抗体- Pacific Blue偶联物的低亮度。 图片左角列出了每种偶联物的染色指数（SI）。

在线工具： 荧光光谱查看器和Panel Builder流式配色工具

在赛默飞官网，荧光光谱查看器可以展示荧光染料以及荧光蛋白的激发和发射光谱，一起为您的多色流式细胞术实验完成流式配色，选择合适的染料。 输入流式仪器的激光器和滤光片配置（图4），然后选择合适的荧光染料。 图5是一个5色流式Panel实例。 此外，荧光光谱查看器还有查看光谱重叠功能，您可通过表格查看每个通道内每种染料的荧光重叠（表2）。 如需使用荧光光谱查看器，请访问此页面查看。

只需简单五步，我们的Panel Builder流式配色工具即刻为您的流式实验选择合适的荧光抗体： 1)访问 Panel Builder流式配色工具，2) 选择合适的实验蛋白靶标（包含细胞活性染料），3) 选择您需要的荧光染料。在每个激光的选项卡显示与靶标匹配的荧光染料。4) 在每个单元格显示可用的产品数量，从列表中选择所需产品。 最后，您的流式Panel已经完成，还可以下载PDF或Excel版本到您的电脑中。

荧光光谱查看器组成概览
图 4. Molecular Probes荧光光谱查看器组成概览。 相同荧光染料的(A)激发光谱和(B)发射光谱。 (C)激光激发波长。 (D)带通发射滤光片波长。
 
荧光光谱查看器显示的五色组合
图 5. Molecular Probes荧光光谱查看器显示的五色组合。 由405 nm 激光激发的Pacific Blue染料（紫色）、由405 nm 激光激发的LIVE/DEAD可固定死亡细胞黄色染色剂（黄色）、由488 nm激光激发的R-藻红蛋白（PE，橙色）、由561 nm激光激发的Alexa Fluor 647– PE（红色）以及由633 nm激光激发的Alexa Fluor 750–别藻蓝蛋白（棕色）的发射曲线。 所示激光为405 nm（紫色）、488 nm（蓝色）、561 nm（黄色）和633 nm（红色）。

表 2. 五种举例的荧光染料荧光光谱查看器中的光谱重叠表格（图5）和Attune NxT流式细胞仪的发射滤光片配置。

荧光基团带通（BP）发射滤光片（nm）
440/50574/26670/14780/60
Pacific Blue 染料48.2%0.9%0.0%0.0%
LIVE/DEAD可固定细胞死活染料，黄色0.2%20.3%2.2%0.0%
PE0.0%53.7%1.2%0.0%
PE-Alexa Fluor 6470.0%3.3%28.9%0.1%
APC-Alexa Fluor 7500.0%0.0%2.9%66.1%
百分比代表使用指定发射滤光片（与激发光源无关）检测得到的相对荧光信号。 574/26 nm带通滤光片分别收集20.3%的LIVE/DEAD可固定细胞死活黄色染色剂荧光和53.7%的PE荧光染料荧光。 但，它们的荧光光谱实际上并无重叠，因为LIVE/DEAD染色剂在405 nm处激发而非488 nm，PE在488 nm处激发而非405 nm；即，它们是被不同激光激发的。

参考文献

  1. Perfetto SP, Chattopadhyay PK, Roederer M (2004) Nat Rev Immunol 4:648–655.
  2. Maecker HT, Frey T, Nomura LE, Trotter J (2004) Cytometry A 62:169–173.
  3. Maecker HT, Trotter J (2006) Cytometry A 69:1037–1042.
  4. Mahnke YD, Roederer M (2007) Clin Lab Med 27:469–485.

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