将 CHO 细胞从单层转换成悬浮培养

1. 从 T-25 培养瓶中倒出培养基，并使用 3 mL（T-75 培养瓶使用 5 mL）无钙和无镁 D-PBS（货号 14190）洗涤单层。培养物应为 50% 至 80% 汇合度，以确保细胞主动分裂。
2. 倒出 PBS。加入 3 mL（T-75 培养瓶加入 5 mL）胰蛋白酶-EDTA（0.05% 胰蛋白酶、0.53 mM EDTA·4Na，货号 25300）。短暂旋转并倒出胰蛋白酶-EDTA，但留下一层液体薄膜覆盖单层。在显微镜下观察细胞。当细胞聚拢时，在实验台上轻敲培养瓶，以分散细胞。
3. 向细胞悬浮液中加入 6 mL 培养基（T-75 培养瓶加入 10 mL），并以 100 X g 离心 4 分钟。连同上清液吸出稀释的胰蛋白酶。对于无血清培养基，我们建议使用大豆胰蛋白酶抑制剂（货号 17075）来终止酶促作用。制备大豆胰蛋白酶抑制剂的 0.25 mg/mL 储备液。此储备液与胰蛋白酶溶液按 1:1 (v:v) 的比例配合使用。
4. 倒出上清液，并重复步骤 3。
5. 倒出上清液，将细胞重悬于 5 mL 培养基中。取出等份试液，以确定活细胞计数。
6. 测定 5 x 10⁵ 个活细胞/mL 所需的细胞悬浮液体积。向无菌转瓶或摇瓶中加入适量培养基和细胞悬浮液。留出足够的顶空以进行充分的气体交换（即，250 mL 转瓶中加入 100 mL 培养基，或 250 mL 摇瓶中加入 75 至 100 mL 培养基）。对于已经不含剪切保护剂的无血清培养基，添加 PLURONIC® F68，使得最终浓度为 0.1%。
7. 松开盖子以进行气体交换，并将其置于 37^oC、空气中含 5% 至 10% CO₂ 的湿润环境下。将叶轮转速设置为 75-95 rpm（Corning 转瓶；对于搅拌桨型叶轮，转速可能需要降低）。摇瓶可在定轨摇床平台上以 125 至 135 rpm 的转速进行旋转。

注：您可以将转瓶叶轮转速设置为您的正常转速（80 至 100 rpm）。如果细胞存活率降至 85% 以下，则以 10 rpm 的减量降低转速，直至存活率良好。

8. 每日检查活细胞密度，以确定悬浮培养物中的生长动力学。
9. 当活细胞密度达到 1 x 10⁶ 个细胞/mL 时（或接种后第 4 天），以 5 x 10⁵ 个细胞/mL 的密度对细胞进行传代（如果细胞密度在第 4 天时未达到 1 x 10⁶个细胞/mL，可能需要离心然后添加新鲜培养基）。
10. 一旦接种后第 3 天时细胞密度达到至少 1 x 10⁶个细胞/mL，存活率至少为 90%，持续了 3 代，则可认为细胞适用于悬浮培养。接种密度可降低至 2 x 10⁵ 至 3 x 10⁵ 个细胞/mL。

PLURONIC® 是 BASF Corporation 的注册商标。