解冻和建立大鼠神经胶质前体细胞 (GPC)

我们建议您在复苏后立即使用大鼠神经胶质前体细胞。解冻大鼠 GPC 后，将细胞扩增一次，使其数量增加两倍，然后收获细胞，用于您的实验。

需要的材料

• 大鼠神经胶质前体细胞（货号 N7746-100），储存于液氮中
• CELLstart 底物或聚-L-鸟氨酸包被、经组织培养处理的培养瓶、培养板或皮氏培养皿
• GPC 完全生长培养基*，预热至 37°C * StemPro NSC SFM 完全培养基（货号 A1050901），添加 2 mM GlutaMAX-I （货号 35050-061）和 10 ng/mL PDGF-AA（货号 PHG0035）
• 15 mL 一次性无菌锥形管，用生长培养基预冲洗
• 37°C 水浴
• 37°C 培养箱，含 5% CO₂ 加湿空气
• 经火焰抛光和高压灭菌的玻璃巴斯德吸管，或用生长培养基预冲洗的塑料巴斯德吸管
• 血细胞计数器、细胞计数仪和台盼蓝（货号 15250-061）、LIVE/DEAD 细胞活力检测试剂盒（货号 L34951），或 Countess 自动细胞计数仪（货号 C10227）

注：大鼠 GPC 容易粘附在细胞培养皿和离心管中使用的塑料材料上。使用前，用培养基冲洗所有会与细胞接触的材料，以防止细胞粘附在塑料上。

1. 用生长培养基预冲洗培养瓶、培养板或皮氏培养皿，以包被塑料表面。确保预冲洗任何会与细胞接触的其他材料，以防止细胞粘附在塑料上。
2. 从液氮储存设备中取出细胞，立即将细胞转移至 37°C 水浴中，以防止形成冰晶。
3. 在 37°C 水浴中轻轻涡旋样品瓶，使瓶中的细胞迅速解冻，并在最后一点冰融化时（通常 < 2分钟）取出。请勿完全浸没样品瓶。解冻细胞时间不得超过2分钟。请勿将气泡引入细胞悬液中，因为气泡会降低细胞活力。
4. 解冻后，将含有细胞的试管转移至层流罩中，并用 70% 异丙醇洗涤试管外部。
5. 使用培养基冲洗移液器吸头，轻轻地将细胞转移到预冲洗的 15 mL 离心管中。
6. 用 1 mL 生长培养基冲洗样品瓶，并逐滴加入（每秒一滴）15 mL 离心管内的细胞中。每次滴液后轻轻涡旋混匀。
7. 向细胞溶液中缓慢加入 2 mL 生长培养基，轻轻混匀。
8. 使用您选择的方法进行活细胞计数。解冻细胞的存活率应 > 50%，总活细胞数应 >1 x 10⁶。
9. 以 3 x 10⁴–5 x 10⁴ 个细胞/cm² 的接种密度将细胞铺于 CELLstart 底物或聚-L-鸟氨酸包被、经组织培养处理的培养皿上。如有必要，向细胞中轻轻加入生长培养基，以达到所需的细胞浓度，并重新进行细胞计数。
10. 在 37°C、5% CO₂、90% 湿度条件下孵育，使细胞贴壁至少24小时。
11. 第二天，将培养基替换为等体积的新鲜、预热的完全生长培养基。每隔一天更换一次培养基，并在培养达到 75–90% 的融合度时进行细胞传代。