Cellfectin® II 试剂是一种具有专利技术的阳离子脂质体制剂,溶于膜过滤水中,适用于将 DNA 转染至昆虫细胞中。Cellfectin® II 试剂是改进的 Cellfectin® 试剂,具有与 Cellfectin® 相同的性能且适用于更快的方案。在来自 Invitrogen 的 Bac-to-Bac®、BaculoDirect™ 和 InsectSelect™ 表达系统或等效系统中使用 Cellfectin® II 进行转染,可连续有效地转染 Sf9、Sf21 和 High Five™ 细胞。Cellfectin® II 试剂还可用于转染贴壁或悬浮的哺乳动物细胞。本手册描述了 Sf9 和 Sf21 细胞的转染方案。关于使用 Cellfectin® II 转染 High Five™ 昆虫细胞和哺乳动物细胞的情况,请参阅转染选择工具。
转染重要指南
- Cellfectin® II 是一种脂质体悬浮液,可随时间沉降。使用前倒置试管 5-10 次使溶液彻底混合。
- 与使用 Cellfectin® 试剂相比,使用 Cellfectin® II 时 DNA:脂质体复合物的形成时间更短(约 15-30 分钟)。
- 使用适用于您的系统和细胞类型的方案进行转染以获得出色结果。
- 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素,因为这会导致细胞死亡。
- 转染复合物必须在无血清培养基中形成。
- 检测无血清培养基与 Cellfectin® II 的兼容性,因为一些无血清制剂可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。
优化转染
为获得较高的转染效率并尽可能减少非特异性影响,通过改变细胞密度、DNA 和 Cellfectin® II 浓度以及转染孵育时间优化转染条件。
使用以下程序以 6 孔规格转染在补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基中培养的 Sf9 或 Sf21 昆虫细胞。所有用量和体积均按每孔给出。
- 如果细胞密度在 1.5-2.5 × 106 个细胞/mL 范围内且存活率 > 95%,并且培养基不含抗生素,则继续进行步骤 1a。如果细胞密度不在此范围内或培养基含有抗生素,请进行步骤 1b-1c。
- a. 向各孔中添加 2 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基(不含抗生素和血清)。以 8 × 105 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。请勿更换培养基或洗涤细胞。转入下一步的培养基将提高转染效率。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。
继续进行步骤 2。 - b. 通过混合 1.5 mL 补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基(不含抗生素)和 8.5 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基(不含 FBS 和抗生素),制备 10 mL 铺板培养基。
- c. 以 8 × 105 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。去除培养基。向每孔中添加来自步骤 1b 的 2.5 mL 铺板培养基。继续进行步骤 2。
- 对于每份转染样本,按下列步骤制备复合物:
Bac-to-Bac® 系统 | BaculoDirect™ 系统 |
a. 使用前混合 Cellfectin® II,并在 100 μL 无补充剂的 Grace 培养基中稀释 8 μL 该试剂。短暂涡旋以混合。
注:该混合物可在室温下保存长达 30 分钟 |
a. 制备转染混合物 A:8 μL Cellfectin® II,100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基
注:该混合物可在室温下保存长达 30 分钟。 |
b. 在 100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基中稀释 1 μg 杆状病毒 DNA。轻轻混匀。 | b.制备转染混合物 B:10 μL LR 重组反应物,100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基 |
c. 混合稀释的 DNA 与稀释的 Cellfectin® II(总体积约为 210 μL)。轻轻混匀并在室温下孵育 15-30 分钟。 | c.混合转染混合物 A 和 B。轻轻混匀并在室温下孵育 25-35 分钟 |
- 将约 210 μL DNA-脂质体混合物或转染混合物(步骤 2c)逐滴加至步骤 1a 或 1c 的细胞上。在 27°C 下孵育细胞 3-5 小时。
- 去除转染混合物,并更换为 2 mL 完全生长培养基(例如,补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基)。对于 Bac-to-Bac® 系统,可以选择使用抗生素。使用含 100 μM 更昔洛韦的完整培养基用于 BaculoDirect™ 系统。
- 在 27°C 下孵育细胞 72 小时,或直至您看到病毒性感染迹象。
使用此程序在 Sf-900 II SFM、Sf-900™ III SFM 或 Grace 昆虫培养基中以 6 孔规格转染 Sf9 和 Sf21 昆虫细胞。所有用量和体积均按每孔给出。
- 对于在不含抗生素的 Sf-900 II SFM 或 Sf-900™ III SFM 中培养的对数期细胞:在 2 mL Sf-900 II SFM 或 Sf-900™ III SFM 中以 8 × 105 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。使细胞在室温下贴壁 15 分钟。继续进行步骤 2。
对于在 Grace 昆虫培养基中培养的细胞:如果细胞密度在 1.5-2.5 × 106 个细胞/mL 范围内且存活率 > 95%,并且培养基不含抗生素,则继续进行步骤 1a。如果细胞密度不在此范围内或培养基含有抗生素,请进行步骤 1b-1c。
- a. 向各孔中添加 2 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基(不含抗生素和血清)。以 8 × 105 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。请勿更换培养基或洗涤细胞。转入下一步的培养基将提高转染效率。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。
继续进行步骤 2。 - b. 通过混合 1.5 mL 补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基(不含抗生素)和 8.5 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基(不含 FBS 和抗生素),制备 10 mL 铺板培养基。
- c. 以 8 × 105 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。去除培养基。向每孔中添加来自步骤 1b 的 2.5 mL 铺板培养基。继续进行步骤 2。
- 对于每份转染样本,按下列步骤制备复合物:
- a. 在 100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基(不含抗生素和血清)中稀释 1 μg 质粒 DNA。短暂涡旋以混合。在室温下孵育 15-30 分钟。
可选:如果您使用的是 SFM,向稀释的 DNA 中添加 5 μL PLUS™ 试剂(货号 11514-015),以提高转染效率。
- b. 使用前混合 Cellfectin® II,然后在 100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基(不含抗生素和血清)中稀释 8 μL Cellfectin® II。短暂涡旋以混合。在室温下孵育 15-30 分钟。
- c. 混合稀释的 DNA 与稀释的 Cellfectin® II(总体积约为 210 μL)。轻轻混匀并孵育 5-15 分钟。
- 将约 210 μL DNA-脂质体混合物(步骤 2c)逐滴加至步骤 1a 或 1c 的细胞上。
- 对于 Sf-900 II SFM 或 Sf-900™ III SFM:在 27°C 下孵育细胞 24-48 小时,并检测转基因表达。无需更换培养基。对于 Grace 培养基:在 27°C 下孵育细胞 3-5 小时。去除转染混合物,并更换为 2 mL 完全生长培养基(例如,补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基)。可以选择在生长培养基中添加抗生素。在 27°C 下孵育细胞 24-48 小时,并检测转基因表达。
100003529.pps MAN0000759 2010 年 6 月 11 日