Cellfectin® II 试剂

Cellfectin® II 试剂是一种具有专利技术的阳离子脂质体制剂，溶于膜过滤水中，适用于将 DNA 转染至昆虫细胞中。Cellfectin® II 试剂是改进的 Cellfectin® 试剂，具有与 Cellfectin® 相同的性能且适用于更快的方案。在来自 Invitrogen 的 Bac-to-Bac®、BaculoDirect™ 和 InsectSelect™ 表达系统或等效系统中使用 Cellfectin® II 进行转染，可连续有效地转染 Sf9、Sf21 和 High Five™ 细胞。Cellfectin® II 试剂还可用于转染贴壁或悬浮的哺乳动物细胞。本手册描述了 Sf9 和 Sf21 细胞的转染方案。关于使用 Cellfectin® II 转染 High Five™ 昆虫细胞和哺乳动物细胞的情况，请参阅转染选择工具。

转染重要指南

• Cellfectin® II 是一种脂质体悬浮液，可随时间沉降。使用前倒置试管 5-10 次使溶液彻底混合。
• 与使用 Cellfectin® 试剂相比，使用 Cellfectin® II 时 DNA:脂质体复合物的形成时间更短（约 15-30 分钟）。
• 使用适用于您的系统和细胞类型的方案进行转染以获得出色结果。
• 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
• 转染复合物必须在无血清培养基中形成。
• 检测无血清培养基与 Cellfectin® II 的兼容性，因为一些无血清制剂可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。

优化转染

为获得较高的转染效率并尽可能减少非特异性影响，通过改变细胞密度、DNA 和 Cellfectin® II 浓度以及转染孵育时间优化转染条件。

使用以下程序以 6 孔规格转染在补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基中培养的 Sf9 或 Sf21 昆虫细胞。所有用量和体积均按每孔给出。

1. 如果细胞密度在 1.5-2.5 × 10⁶ 个细胞/mL 范围内且存活率 > 95%，并且培养基不含抗生素，则继续进行步骤 1a。如果细胞密度不在此范围内或培养基含有抗生素，请进行步骤 1b-1c。


• a. 向各孔中添加 2 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基（不含抗生素和血清）。以 8 × 10⁵ 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。请勿更换培养基或洗涤细胞。转入下一步的培养基将提高转染效率。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。
  继续进行步骤 2。
• b. 通过混合 1.5 mL 补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基（不含抗生素）和 8.5 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基（不含 FBS 和抗生素），制备 10 mL 铺板培养基。
• c. 以 8 × 10⁵ 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。去除培养基。向每孔中添加来自步骤 1b 的 2.5 mL 铺板培养基。继续进行步骤 2。


2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：
   
   

   Bac-to-Bac® 系统	BaculoDirect™ 系统
   a. 使用前混合 Cellfectin® II，并在 100 μL 无补充剂的 Grace 培养基中稀释 8 μL 该试剂。短暂涡旋以混合。 注：该混合物可在室温下保存长达 30 分钟	a. 制备转染混合物 A：8 μL Cellfectin® II，100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基 注：该混合物可在室温下保存长达 30 分钟。
   b. 在 100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基中稀释 1 μg 杆状病毒 DNA。轻轻混匀。	b.制备转染混合物 B：10 μL LR 重组反应物，100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基
   c. 混合稀释的 DNA 与稀释的 Cellfectin® II（总体积约为 210 μL）。轻轻混匀并在室温下孵育 15-30 分钟。	c.混合转染混合物 A 和 B。轻轻混匀并在室温下孵育 25-35 分钟

3. 将约 210 μL DNA-脂质体混合物或转染混合物（步骤 2c）逐滴加至步骤 1a 或 1c 的细胞上。在 27°C 下孵育细胞 3-5 小时。


4. 去除转染混合物，并更换为 2 mL 完全生长培养基（例如，补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基）。对于 Bac-to-Bac® 系统，可以选择使用抗生素。使用含 100 μM 更昔洛韦的完整培养基用于 BaculoDirect™ 系统。


5. 在 27°C 下孵育细胞 72 小时，或直至您看到病毒性感染迹象。

1. 对于在不含抗生素的 Sf-900 II SFM 或 Sf-900™ III SFM 中培养的对数期细胞：在 2 mL Sf-900 II SFM 或 Sf-900™ III SFM 中以 8 × 10⁵ 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。使细胞在室温下贴壁 15 分钟。继续进行步骤 2。
   
   对于在 Grace 昆虫培养基中培养的细胞：如果细胞密度在 1.5-2.5 × 10⁶ 个细胞/mL 范围内且存活率 > 95%，并且培养基不含抗生素，则继续进行步骤 1a。如果细胞密度不在此范围内或培养基含有抗生素，请进行步骤 1b-1c。
   
   
   • a. 向各孔中添加 2 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基（不含抗生素和血清）。以 8 × 10⁵ 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。请勿更换培养基或洗涤细胞。转入下一步的培养基将提高转染效率。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。
     继续进行步骤 2。
   • b. 通过混合 1.5 mL 补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基（不含抗生素）和 8.5 mL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基（不含 FBS 和抗生素），制备 10 mL 铺板培养基。
   • c. 以 8 × 10⁵ 个 Sf9 或 Sf21 细胞/孔对细胞进行铺板。使细胞在通风柜中在室温下贴壁 15 分钟。去除培养基。向每孔中添加来自步骤 1b 的 2.5 mL 铺板培养基。继续进行步骤 2。
   
   


2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：
   
   
   • a. 在 100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基（不含抗生素和血清）中稀释 1 μg 质粒 DNA。短暂涡旋以混合。在室温下孵育 15-30 分钟。
     
     可选：如果您使用的是 SFM，向稀释的 DNA 中添加 5 μL PLUS™ 试剂（货号 11514-015），以提高转染效率。
     
     
   • b. 使用前混合 Cellfectin® II，然后在 100 μL 无补充剂的 Grace 昆虫培养基（不含抗生素和血清）中稀释 8 μL Cellfectin® II。短暂涡旋以混合。在室温下孵育 15-30 分钟。
     
   
   
   • c. 混合稀释的 DNA 与稀释的 Cellfectin® II（总体积约为 210 μL）。轻轻混匀并孵育 5-15 分钟。
   
   


3. 将约 210 μL DNA-脂质体混合物（步骤 2c）逐滴加至步骤 1a 或 1c 的细胞上。
   


4. 对于 Sf-900 II SFM 或 Sf-900™ III SFM：在 27°C 下孵育细胞 24-48 小时，并检测转基因表达。无需更换培养基。对于 Grace 培养基：在 27°C 下孵育细胞 3-5 小时。去除转染混合物，并更换为 2 mL 完全生长培养基（例如，补充 10% FBS 的 Grace 昆虫培养基）。可以选择在生长培养基中添加抗生素。在 27°C 下孵育细胞 24-48 小时，并检测转基因表达。