FreeStyle™ MAX Reagent i

介绍

FreeStyle™ MAX 试剂是一种具有专利技术的非动物源性制剂，用于将质粒 DNA 转染到真核细胞中，可轻松扩大该转染的规模以生产大量重组蛋白。使用 FreeStyle™ MAX

试剂可在生物生产应用中获得极高表达水平和转染率，且细胞毒性极低，经过专门配制可与以下产品配合使用：

  • 无血清 FreeStyle™ 293 表达培养基（货号 12338-018）中的 FreeStyle™ 293-F 细胞（悬浮人胚肾细胞，货号 R790-07）
  • 无血清 FreeStyle™ CHO 表达培养基（货号 12651-014）中的 FreeStyle™ CHO-S 细胞（悬浮中国仓鼠卵巢细胞，货号 R800-07）
  • 含 8 mM L-谷氨酰胺和 18 mL/L 10% Pluronic F-68 的 CD DG44 培养基中的 DG44 细胞（DHFR- 悬浮 CHO 细胞）（货号 12609-012、12613-014）FreeStyle™ MAX 试剂应与 FreeStyle™ MAX 293 表达系统（货号 K9000-20）、FreeStyle™ MAX CHO 表达系统（货号 K9000-10）和 OptiCHO™ Express 试剂盒（货号 12745-014）配合使用。

要了解更多信息，请访问我们的网站 ( www.invitrogen.com) 或联系技术支持部。


转染指南

  • FreeStyle™ 293-F 和 CHO-S 细胞以及 DG44 细胞应在定轨摇床上于加湿、37℃、含 8% CO2 的环境中悬浮培养。
  • 转染 CHO-S 细胞时可使用 0.5X Pen/Strep（货号 15140-122），但是许多其他 FreeStyle™ MAX 转染是在没有抗生素的情况下进行的。请在无菌条件下工作并防止 DNA 污染。
  • 细胞结团会降低转染效率；可通过建议的传代频次和搅拌（参见下文）来防止此情况。在常规培养过程中或转染前，请勿对细胞使用抗结团剂。可在转染后添加抗结团剂（货号 0010057AE）。
  • 我们建议使用液体 OptiPRO™ SFM (1X)（100 mL，货号 12309-050）稀释 DNA 和脂质体，然后形成复合物。

方案 - 培养 FreeStyle™ 细胞

对 FreeStyle™ 293-F 细胞进行常规培养时，以 135–155 rpm 的速度振摇，并将细胞密度保持在 0.1 至 3.0 × 10 6 个细胞/mL 培养物之间。细胞密度高于 3.0 × 10 6 个细胞/mL 将导致转染效率降低。对 FreeStyle™ CHO-S 细胞进行常规培养时，以 120–135 rpm 的速度振摇，并将细胞密度保持在 0.05 至 1.5 × 10 6 个细胞/mL 培养物之间。确保使用 L-谷氨酰胺（货号 25030-081）补充 FreeStyle™ CHO 表达培养基，使得最终浓度为 8 mM。如果需要大量细胞，以 0.5 × 10 6 个细胞/mL 的密度接种培养物，一旦细胞密度达到 5 × 10 6 个细胞/mL（3–4 天），立即使用细胞。

转染 FreeStyle™ 细胞用于蛋白表达

使用此程序将 DNA 转染至 FreeStyle™ 293-F 或 CHO-S 细胞中。使用无菌 DNA，或在使用前进行过滤灭菌（在过滤后重新定量测定 DNA）。对于 125 mL 摇瓶中的 30 mL 培养物，所有用量均按每个培养瓶给出；对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”（下文）。

  1. 转染前约 24 小时，以 6–7 × 105 个细胞/mL 的密度对 FreeStyle™ 293-F 细胞进行传代，以 135–155 rpm 的速度振摇。以 5–6 × 105 个细胞/mL 的密度对 FreeStyle™ CHO-S 细胞进行传代，以 120–135 rpm 的速度振摇。在 37°C、8% CO2 条件下进行培养。

  2. 转染当天，细胞密度应约为 1.2–1.5 × 106 个细胞/mL。用生长培养基将细胞稀释至 1 × 106 个细胞/mL。要确保实现出色转染，细胞活力必须 > 95%。向每个培养瓶中添加 30 mL 细胞。

  3. 轻轻翻转装有 FreeStyle™ MAX 试剂的试管 4 次（请勿涡旋）。

  4. 用 OptiPRO™ SFM 稀释 37.5 μg 质粒 DNA，使总体积为 0.6 mL，然后混匀。在另一支试管中，使用 OptiPRO™ SFM 稀释 37.5 μL FreeStyle™ MAX 试剂，使总体积为 0.6 mL，并通过翻转试管（请勿涡旋）轻轻混匀。将稀释的 FreeStyle™ MAX 试剂立即添加至稀释的 DNA 溶液中，使总体积为 1.2 mL，并轻轻混匀。

  5. 在室温下孵育 DNA-脂质体混合物 10–20 分钟，以形成复合物。孵育时间不要超过 20 分钟。

  6. 缓慢地将 1.2 mL DNA-脂质体混合物添加至含细胞的 125 mL 培养瓶中，同时缓慢涡旋培养瓶。

  7. 对于 FreeStyle™ 293-F 细胞和 FreeStyle™ CHO-S 细胞，在 37°C、8% CO2 条件下，在设定为 135 rpm 的定轨摇床上孵育转染后的细胞培养物。最初 6 到 7 天无需更换或补充培养基。

优化 FreeStyle™ 细胞中的蛋白表达

  • 蛋白表达可在转染后 4 至 8 小时内检出，最大蛋白得率通常出现在转染后 1 至 7 天，具体取决于表达的蛋白。
  • 首次表达某种蛋白时，在转染后第 1 至 9 天进行时程实验，以鉴别蛋白生成峰并监测细胞活力。
  • 改变质粒 DNA 和 FreeStyle™ MAX 试剂的用量。对于 30 mL 培养物，尝试使用 24–45 μg 质粒 DNA 和 24–45 μL 脂质体。
  • 对于分泌的 IgG 蛋白的生成，我们在转染后 5 至 7 天观察到得率峰值。
  • 要通过 GFP 型荧光蛋白评估转染效率，我们建议从转染后 24 小时开始对培养物进行监测。
  • 要在优化蛋白表达的同时扩大培养物体积，请参见“扩大或缩小转染规模”（下文）。

扩大或缩小 FreeStyle™ 细胞的转染规模

为在不同培养物体积中转染细胞，根据培养物体积按比例改变 FreeStyle™ MAX 试剂、DNA、细胞和培养基的用量，如下表所示：
 
细胞培养物稀释体积DNAFreeStyle™ MAX 试剂
体积   培养瓶 起点    优化范围起点    优化范围
30 mL     125 mL2 × 0.6 mL37.5 μg                 24–45 μg37.5 μL                 24–45 μL
250 mL     1 升2 × 5 mL312.5 μg               200–375 μg312.5 μL               200–375 μL
1 升       3 升2 × 20 mL1.25 mg                0.8–1.5 mg1.25 mL                0.8–1.5 mL


培养物体积大于 30 mL 时，可能需要进一步调整：

  • 如果产生泡沫，则降低定轨摇床的转速。对于 1 L 培养物，我们建议对 FreeStyle™ CHO-S 细胞采用 70–80 rpm 的转速，对 FreeStyle™ 293-F 细胞采用尽可能接近 135 rpm（不产生泡沫）的转速。
  • 对于 1 L 培养物，我们建议在室温下孵育 DNA-脂质体混合物 20 分钟以形成复合物。孵育时间不要超过 20 分钟。

转染 DG44 细胞以生成稳定细胞系

使用此程序将线性化 DNA 转染至 DG44 细胞中。在 125 mL 摇瓶中使用 30 mL 培养物；所有用量均按每个培养瓶给出。有关培养和其他信息，请参见 OptiCHO™ Express 试剂盒手册（可从我们的网站 www.invitrogen.com 获取，或联系技术支持部获取）。

  1. 转染前 48 小时，在 37°C、8% CO2 条件下，以 3 × 105 个细胞/mL 的密度对 DG44 细胞进行传代，以 130–135 rpm 的速度振摇。在含 8 mM L-谷氨酰胺和 18 mL/L 10% Pluronic F-68 的 CD DG44 培养基（货号分别为 25030-081、24040-032 和 12610-010）中进行培养。

  2. 转染前 24 小时，再次以 3 × 105 个细胞/mL 的密度对 DG44 细胞进行传代。

  3. 转染当天，将 CD DG44 培养基（含 8 mM L-谷氨酰胺和 18 mL/L 10% Pluronic F-68）预热至 37°C。

  4. 对细胞进行计数（活力必须 > 95%），向每个培养瓶中添加含 1.5 x107 个细胞的总体积为 30 mL 的 CD DG44 培养基。将培养瓶置于摇床中，直至转染。

  5. 轻轻翻转装有 FreeStyle™ MAX 试剂的试管 4 次（请勿涡旋）。

  6. 将 18 μg 线性化 DNA 和 15 μL FreeStyle™ MAX 试剂添加至 1.2 mL OptiPRO™ SFM（室温下）并轻轻翻转以混匀。

  7. 在室温下孵育 DNA-脂质体混合物 10 分钟，以形成复合物。孵育时间不要超过 20 分钟。

  8. 缓慢地将 1.2 mL DNA-脂质体混合物添加至含细胞的 125 mL 培养瓶中，同时缓慢涡旋培养瓶。

  9. 在 37°C、8% CO2 条件下，在以 130–135 rpm 速度旋转的定轨摇床平台上孵育转染后的细胞培养物。

  10. 转染后 48 小时，将细胞置于选择性培养基（CD OptiCHO™ 培养基，货号 12681-011）中。
16447.pps    2008 年 8 月 29 日