Human Mesenchymal Stem Cells Lipofectamine 2000

介绍

Lipofectamine 2000 试剂是一种具有专利技术的制剂,可帮助将 Stealth™ RNAi 或短干扰 RNA (siRNA) 高效递送至哺乳动物细胞中从而进行 RNAi 分析。本参考文献提供了使用 Lipofectamine 2000(货号 11668-027)将 Stealth™ RNAi(或 siRNA)转染至人 MSC 间充质干细胞(Cambrex BioScience,货号 PT-2501)的一般指南和优化程序。
 
注:虽然已对转染条件进行了优化,以便将 Stealth™ RNAi 高效递送至 MSC 细胞,但是与感兴趣靶基因相关的其他因素(包括靶基因的转录速率、所得蛋白的稳定性和选择的 Stealth™ RNAi 序列的效率)可能会影响观察到的靶基因敲低程度。设计 RNAi 实验时请考虑这些因素。

转染指南

用 Lipofectamine 2000 将 Stealth™ RNA(或 siRNA)转染至 MSC 细胞时,请遵循以下重要指南:
 

  1. 使用与 2 µg/mL Lipofectamine 2000(储备液浓度为 1 mg/mL)形成复合物的 400 nM Stealth™ RNAi(或 siRNA)进行转染。为了提高准确性并降低检测变异性,我们建议针对每个样本条件进行三次平行转染。
  2. 在汇合度为 70% 时转染 MSC 细胞。
  3. 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素,因为这会降低转染效率并导致细胞死亡。
  4. 使用 Opti-MEM I 减血清培养基(货号 31985-062)稀释 Lipofectamine 2000 和 Stealth™ RNAi(或 siRNA),然后形成复合物。

材料

开始前请准备好以下试剂:

    * MSC 细胞,在添加 MSCGM SingleQuots(Cambrex BioScience,货号 PT-4105)的间充质干细胞基础培养基(MSCBM;Cambrex BioScience,货号 PT-3238)中培养

注:使用低代数细胞(传代 5 或更低);确保转染前细胞健康且存活率超过 90%。

    * 感兴趣 Stealth™ RNAi(或 siRNA)(20 µM,溶于退火缓冲液)
    * Lipofectamine 2000 试剂(使用前储存在 +4°C 下)
    * Opti-MEM I 减血清培养基(使用前预热至 37°C)
    * 适当的组织培养板和耗材

方案

通过此程序在 24 孔规格板中使用 Lipofectamine 2000 将 Stealth™ RNAi(或 siRNA)转染至 MSC 细胞。对于其他规格,根据下文推荐试剂用量和体积中的表格确定添加的合适试剂用量。提示:为降低转染多份重复样本(如三份重复样本)时的孔间变异性,按比例扩大试剂体积以形成复合物(第 2 步),然后将等体积的复合物等分至各孔中。
 

  1. 转染前一天,在含有 400 µL 不含抗生素的生长培养基的孔中对 3 x 104 个 MSC 细胞进行铺板。转染时细胞汇合度应达到 70%。
  2. 对每份转染样本,按下列步骤制备 Stealth™ RNAi-Lipofectamine 2000 复合物:


    • 用 50 µL Opti-MEM I   减血清培养基稀释 200 pmol RNAi Stealth™ RNAi(即,10 µL 的 20 µM Stealth™ RNAi)。轻轻混匀。
    • 使用前轻轻混匀 Lipofectamine™ 2000,然后取 1 µL 在 50 µL Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀并在室温下孵育 15 分钟。    
    • 孵育 15 分钟后,混合稀释的 Stealth™ RNAi 和稀释的 Lipofectamine 2000(总体积 = 111 µL)。轻轻混匀并在室温下孵育 15 分钟以形成复合物(溶液可能变得浑浊)。


  3. 将 111 µL Stealth™ RNAi-Lipofectamine 2000 复合物添加至含有细胞和培养基的各孔中。通过来回摇动平板轻轻混匀。

  4. 在加湿 CO2  培养箱中于 37°C 下孵育细胞 16-24 小时,直至您准备好检测基因敲低效果。

 

推荐试剂用量和体积

为在不同尺寸的组织培养容器中转染 MSC 细胞,按表中所示根据相对表面积按比例改变 Stealth™ RNAi(或 siRNA)、Lipofectamine 2000、细胞和培养基的用量。注:20 µM Stealth™ RNAi 或 siRNA = 20 pmol/µL。

培养容器
相对表面积(vs. 24 孔板)
每孔铺板细胞数量
铺板培养基体积
培养基体积 (µL) 中含有的 Stealth RNAi (pmol)
培养基体积 (µL) 中含有的 Lipofectamine 2000 (µL)
48 孔
         0.4
  1.5 x 10 4
       200 µL
      25 µL 中含有 80 pmol
    25 µL 中含有 0.4 µL
24 孔
           1
     3 x 10 4
       400 µL
    50 µL 中含有 200 pmol
       50 µL 中含有 1 µL
 6 孔
            5
   1.5 x 10 5
          2 mL
250 µL 中含有 1000 pmol
250 µL 中含有 5 µL
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