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Lipofectamine 2000 试剂是一种具有专利技术的制剂,可帮助将 Stealth™ RNAi 或短干扰 RNA (siRNA) 高效递送至哺乳动物细胞中从而进行 RNAi 分析。本参考文献提供了使用 Lipofectamine 2000(货号 11668-027)将 Stealth™ RNAi(或 siRNA)转染至人 MSC 间充质干细胞(Cambrex BioScience,货号 PT-2501)的一般指南和优化程序。
注:虽然已对转染条件进行了优化,以便将 Stealth™ RNAi 高效递送至 MSC 细胞,但是与感兴趣靶基因相关的其他因素(包括靶基因的转录速率、所得蛋白的稳定性和选择的 Stealth™ RNAi 序列的效率)可能会影响观察到的靶基因敲低程度。设计 RNAi 实验时请考虑这些因素。
转染指南
用 Lipofectamine 2000 将 Stealth™ RNA(或 siRNA)转染至 MSC 细胞时,请遵循以下重要指南:
开始前请准备好以下试剂:
* MSC 细胞,在添加 MSCGM SingleQuots(Cambrex BioScience,货号 PT-4105)的间充质干细胞基础培养基(MSCBM;Cambrex BioScience,货号 PT-3238)中培养
注:使用低代数细胞(传代 5 或更低);确保转染前细胞健康且存活率超过 90%。
* 感兴趣 Stealth™ RNAi(或 siRNA)(20 µM,溶于退火缓冲液)
* Lipofectamine 2000 试剂(使用前储存在 +4°C 下)
* Opti-MEM I 减血清培养基(使用前预热至 37°C)
* 适当的组织培养板和耗材
通过此程序在 24 孔规格板中使用 Lipofectamine 2000 将 Stealth™ RNAi(或 siRNA)转染至 MSC 细胞。对于其他规格,根据下文推荐试剂用量和体积中的表格确定添加的合适试剂用量。提示:为降低转染多份重复样本(如三份重复样本)时的孔间变异性,按比例扩大试剂体积以形成复合物(第 2 步),然后将等体积的复合物等分至各孔中。
为在不同尺寸的组织培养容器中转染 MSC 细胞,按表中所示根据相对表面积按比例改变 Stealth™ RNAi(或 siRNA)、Lipofectamine 2000、细胞和培养基的用量。注:20 µM Stealth™ RNAi 或 siRNA = 20 pmol/µL。
培养容器 | 相对表面积(vs. 24 孔板) | 每孔铺板细胞数量 | 铺板培养基体积 | 培养基体积 (µL) 中含有的 Stealth™ RNAi (pmol) | 培养基体积 (µL) 中含有的 Lipofectamine 2000 (µL) |
48 孔
|
0.4
|
1.5 x 10
4 |
200 µL
|
25 µL 中含有 80 pmol
|
25 µL 中含有 0.4 µL
|
24 孔
|
1
|
3 x 10
4 |
400 µL
|
50 µL 中含有 200 pmol
|
50 µL 中含有 1 µL
|
6 孔
|
5
|
1.5 x 10
5 |
2 mL
|
250 µL 中含有 1000 pmol
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250 µL 中含有 5 µL
|