Lipofectamine 2000 转染试剂

Invitrogen™ Lipofectamine™ 2000 转染试剂是一种用于将核酸（DNA 和 RNA）转染至真核细胞的具有专利技术的制剂，具有以下优势：

• 对于许多细胞类型和规格（例如 96 孔）具有较高的转染效率。有关成功转染的细胞类型列表，请参阅细胞系数据库。
• 在存在或不存在血清的情况下，均可将核酸-Lipofectamine 2000 复合物直接添加至培养基中的细胞中。
• 转染后无需去除复合物或更换/添加培养基，不过，4-6 小时后可以去除复合物。

转染指南

使用以下程序，用短干扰 RNA (siRNA) 或 Invitrogen™ Stealth RNAi™ 转染细胞。

• 使用以下程序，用质粒 DNA 转染细胞。
• 我们建议使用 Gibco™ Opti-MEM™ I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 Lipofectamine 2000 和核酸，然后形成复合物。
• 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
• 在实验之间保持相同的接种条件。
• 检测无血清培养基与 Lipofectamine 2000 的兼容性，因为一些无血清制剂（例如，CD293、SFM II、VP-SFM）可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。

注：有关 RNAi 实验的更多提示，请参阅“RNAi 成功的七个步骤”。该手册可从 www.lifetechnologies.com/RNAi 下载或从技术服务部获取，细胞类型特定 RNAi 转染方案也是如此（参见“RNAi 方案”）。

用血琼脂平板、沙氏葡萄糖琼脂平板和液体巯基乙酸盐培养基检测 Lipofectamine 2000 是否不存在微生物污染，并通过用报告基因质粒转染 CHO-K1 细胞对其进行功能检测。

使用此简单程序将 Stealth RNAi 或 siRNA 转染至 24 孔规格板内的哺乳动物细胞中。对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”。所有用量和体积均按每孔给出。使用此程序作为起点；如“优化 Stealth RNAi 或 siRNA 转染”中所述优化转染，特别是首次转染哺乳动物细胞系时。

1. 转染前一天，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基中对细胞进行铺板，使得转染时的汇合度达到 30-50%。注：在更低密度时进行转染可以让转染和检测之间的时间间隔更长，并且使细胞过量生长造成的细胞活力损失最小。


2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备低聚体-Lipofectamine 2000 复合物：
   • a. 使用 50 μL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基稀释 20 pmol Stealth RNAi 或 siRNA 低聚体（当添加至细胞中时，RNA 的最终浓度为 33 nM）。轻轻混匀。
   
   
   • b. 使用前轻轻混匀 Lipofectamine 2000，然后取 1 μL 在 50 μL Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀并在室温下孵育 5 分钟。注：在 25 分钟内继续进行步骤 c。
   
   
   • c. 孵育 5 分钟后，混合稀释的低聚体和稀释的 Lipofectamine 2000。轻轻混匀并在室温下孵育 20 分钟（溶液可能变得浑浊）。



3. 将低聚体-Lipofectamine 2000 复合物添加至含有细胞和培养基的各孔中。通过来回摇动平板轻轻混匀。在 CO₂ 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 24-96 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。培养基可在 4-6 小时后更换。

为获得较高的转染效率和较低的非特异性效应，通过改变 RNA 和 Lipofectamine 2000 浓度来优化转染条件。对于 24 孔规格板，检测 10-50 pmol RNA 和 0.5-1.5 µL Lipofectamine 2000。根据靶基因性质，在优化条件时也可考虑以更高密度转染细胞。

使用以下程序将 DNA 转染至 24 孔规格板内的哺乳动物细胞中。对于其他规格，请参见“扩大或缩小转染规模”。所有用量和体积均按每孔给出。对于大多数细胞系，使用 1:2 至 1:3 的 DNA (μg):Lipofectamine 2000 (μL) 比制备复合物。以较高细胞密度转染细胞，从而获得较高效率、较高表达水平，并尽可能降低细胞毒性。可能需要优化（参见“优化质粒 DNA 转染”）。

1. 贴壁细胞：转染前一天，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基中对 0.5-2 x 10⁵ 个细胞进行铺板，使细胞在转染时的汇合度达到 70-90%。悬浮细胞：在即将制备复合物之前，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基中对 4-8 x 10⁵ 个细胞进行铺板。


2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：
   • a. 使用 50 μL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基（或其他不含血清的培养基）稀释 DNA。轻轻混匀。
   
   
   • b. 使用前轻轻混匀 Lipofectamine 2000，然后取适量在 50 μL Opti-MEM I 培养基中稀释。在室温下孵育 5 分钟。注：在 25 分钟内继续进行步骤 c。
   
   
   • c. 孵育 5 分钟后，混合稀释的 DNA 和稀释的 Lipofectamine 2000（总体积 = 100 μL）。轻轻混匀并在室温下孵育 20 分钟（溶液可能变得浑浊）。注：复合物在室温下稳定保存 6 小时。



3. 将 100 μL 复合物添加至含有细胞和培养基的各孔中。通过来回摇动平板轻轻混匀。


4. 在进行转基因表达检测前，在 CO₂ 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 18-48 小时。培养基可在 4-6 小时后更换。


5. 对于稳定细胞系：在转染后 24 小时，以 1:10 的稀释度（或更高稀释度）将细胞传代至新鲜生长培养基中。次日，添加选择性培养基（如需要）。

为获得较高的转染效率和较低的细胞毒性，通过改变细胞密度以及 DNA 和 Lipofectamine 2000 浓度来优化转染条件。确保细胞汇合度大于 90%，并在 1:0.5 至 1:5 的范围内改变 DNA (μg):Lipofectamine 2000 (μL) 比。

为在不同尺寸的组织培养容器中转染细胞，按表中所示根据相对表面积按比例改变 Lipofectamine 2000、核酸、细胞和培养基的用量。对于自动化、高通量系统，在 96 孔板中进行转染时，建议采用 50 µL 的复合体积。
 
注：您可以通过将细胞直接铺板到转染混合物中，进行快速 96 孔板转染。在平板中制备复合物，并向 100 μL 体积中直接添加密度为基础方案中规定的细胞密度的两倍的细胞。在存在复合物的情况下，细胞将照常粘附。

¹  表面积可能不同，具体取决于生产商。
²  DNA 或 RNAi 转染方案的步骤 2a & 2b 中的稀释培养基体积。