protocol

介绍

描述

Lipofectamine 试剂适用于将 DNA 转染至真核细胞中 (1)，并且是溶于膜过滤水中的聚阳离子脂质体 2,3-二油氧基-N-[2(精氨甲酰胺基)乙基]-N,N 二甲基-1-全氟辛基三氟醋酸盐 (DOSPA) 与中性脂质体二油酰基磷脂酰乙醇胺 (DOPE) 的 3:1 (w/w) 脂质体制剂。使用 Plus™ 试剂（货号 11514-015）(2) 增强转染活性以与 DNA 预先形成复合物。有关转染多种细胞类型的方案，请参阅我们的网站。

转染重要指南

  1. 使用以下推荐的 DNA 和 Lipofectamine 用量制备复合物。可能需要进行优化。注：我们建议使用 Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 Lipofectamine 和 DNA，然后形成复合物。

  2. 以较高细胞密度转染细胞：建议转染时的汇合度达到 50-80%，从而获得较高效率、较高表达水平并尽可能降低细胞毒性。可能需要进行优化。在实验之间保持相同的接种条件。

  3. 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。

  4. 检测无血清培养基与 Lipofectamine 的兼容性，因为一些无血清制剂（例如，CD 293、293 SFM II 和 VP-SFM）可能会抑制阳离子脂质体介导的转染。


本产品仅供实验室研究使用。注意：不适用于诊断。尚未确定本产品在诊断或其他临床应用中的安全性和有效性。

转染程序

使用以下程序以 24 孔规格转染贴壁哺乳动物细胞。有关其他规格，请参见“扩大转染规模”。所有用量和体积均按每孔给出。

  1. 转染前一天，在 500 μL 不含抗生素的生长培养基（含有常规用量的血清）中对 2-6 x 104 个细胞进行铺板，使细胞在转染时的汇合度达到 50-80%。

  2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：

    • a. 使用 25 μL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基（或其他培养基）稀释 0.2-0.4 μg DNA。轻轻混匀。
    • b. 使用前轻轻混匀 Lipofectamine，然后使用 25 μL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基（或其他培养基）稀释 0.5-5 μL。轻轻混匀。
    • c. 将已稀释的 DNA 与已稀释的 Lipofectamine 合并（总体积 = 50 μL）。轻轻混匀并在室温下孵育 15-45 分钟（溶液可能变得浑浊）。注：复合物在室温下稳定保存 6 小时。
    • d. 对于每次转染，向含有复合物的试管中添加 0.15 mL Opti-MEM I 培养基（总体积 = 200 μL）。轻轻混匀。

  3. 从细胞中去除生长培养基，并替换为 0.2 mL 不含血清的生长培养基。向各孔中添加 0.2 mL 已稀释的复合物（来自步骤 2d）。通过摇动平板轻轻混匀。

  4. 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 2-24 小时。我们建议从 5 小时开始。

  5. 添加 0.4 mL 含 2X 正常浓度血清的生长培养基，无需去除转染混合物。注：如果转染后观察到毒性，则用新鲜完全培养基（含有常规用量的血清）替换培养基。

  6. 对于瞬时转染：针对您的细胞类型和表达载体，检测转染后 24-72 小时的转基因活性（如适用）。对于稳定转染：在转染后 72 小时，以 1:10 的稀释度将细胞传代至选择性培养基中。

扩大转染规模

为在不同尺寸的组织培养容器中转染细胞，按表中所示根据相对表面积按比例改变 Lipofectamine、DNA、细胞和培养基的用量。

培养容器相较于 24 孔规格的相对表面积铺板培养基体积培养基体积 (μL) 中含有的 DNA (μg)培养基体积 (μL) 中含有的 Lipofectamine (μL)转染培养基体积
24 孔1500 μL25 μL 中含有 0.2-0.4 μg25 μL 中含有 0.5-5 μL0.4 mL
35 mm52 mL100 μL 中含有 1-2 μg100 μL 中含有 2-25 μg0.8 mL
60 mm105 mL300 μL 中含有 3-6 μg300 μL 中含有 6-75 μg2.4 mL
10 cm3015 mL800 μL 中含有 8-16 μg800 μL 中含有 16-200 μg6.4 mL

 

使用 Plus™ 试剂增强转染

利用此程序以 24 孔规格使用 Plus™ 试剂增强转染。对于其他规格，根据相对表面积按比例改变试剂用量（参见上表）。

  1. 执行转染程序的步骤 1。

  2. 对于每份转染样本，按下列步骤制备复合物：

    • a. 使用 25 μL 不含血清的培养基（如 D-MEM）稀释 0.4 μg DNA。
    • b. 使用前混匀 Plus™ 试剂，然后向已稀释的 DNA 中添加 4 μL 混合液。再次混匀，然后在室温下孵育 15 分钟。
    • c. 使用 25 μL 不含血清的培养基稀释 1 μL Lipofectamine；混匀。
    • d. 合并预先形成复合物的 DNA（步骤 2b）和已稀释的 Lipofectamine（步骤 2c）；混匀，然后在室温下孵育 15 分钟。

  3. 将细胞上的培养基替换为 0.2 mL 不含血清的生长培养基。在此步骤中，您可添加血清。向含细胞的每个孔中添加 54 μL DNAPlus™-Lipofectamine 复合物（来自步骤 2d）。通过来回摇动平板轻轻混匀。

  4. 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 3 小时，然后添加 0.25 mL 含 2X 正常浓度血清的生长培养基，无需去除转染混合物。

  5. 继续转染程序的步骤 6

疑难解答

  1. 为防止出现细胞毒性，在较高的汇合度下转染培养物，在转染过程中使用较少的 Lipofectamine 或 DNA，或添加血清。

  2. 如果细胞不能耐受不存在血清的条件，则在存在血清的情况下进行转染。在无血清培养基中制备复合物 45 分钟，然后用含血清的培养基稀释复合物，之后再添加至细胞中。重要提示：重新优化脂质体用量。

参考文献

  1. Hawley-Nelson, P., et al.(1993) Focus 15, 73.

  2. Shih, P., et al.(1997) Focus 19, 52.
18324.lf.pps      2004 年 7 月 9 日