Search Thermo Fisher Scientific
Invitrogen Lipofectamine 2000 试剂采用专有配方,可促进将 Invitrogen Stealth RNA 分子、短干扰 RNA (siRNA) 或质粒 DNA 高效递送到哺乳动物细胞中进行 RNAi 分析 (1, 2)。本参考文件提供了一般指南,本节描述了使用 Lipofectamine® 2000 试剂将质粒 DNA 和 RNAi 分子(即 Stealth RNAi、siRNA、shRNA 质粒或 miRNA 质粒)共转染到哺乳动物细胞中的程序。
转染指南
使用 Lipofectamine 2000 将目标质粒 DNA 和 RNAi 分子共转染到哺乳动物细胞时,请遵循以下一般指南。
* 为提高准确度并减小检测变异性,我们推荐对各样本条件进行三次平行转染。
开始前应准备好以下材料:
根据此程序,使用 Lipofectamine 2000 将质粒 DNA 和 RNAi 分子共转染到哺乳动物细胞中。请参阅建议试剂用量和体积中的表格,了解不同组织培养规格所需加入的适当试剂用量和体积。请记得在实验中纳入适当的阳性和阴性对照。
提示:我们推荐在转染后 24-48 小时收获细胞。
下表列出了以不同组织培养规格转染细胞时所需的推荐试剂用量和体积范围。作为起点,使用位于推荐范围中点附近的一定量质粒 DNA(见第4列)、dsRNA 或 RNAi 载体 DNA(见第5列)和 Lipofectamine 2000(见第7列);然后针对您的细胞系,通过在推荐范围内改变试剂用量进行条件优化。如果希望以96孔规格进行转染,请参阅96孔规格转染指南(下一页)中的其他指南。
示例:我们通常使用 Invitrogen 产品(如 150 ng 质粒 DNA、5 pmol Stealth RNAi 和 1 µl Lipofectamine 2000)以24孔规格转染 GripTite 293 MSR 细胞。
提示:20 µM dsRNA(即 siRNA 或 Stealth RNAi)= 20 pmol/µl。
培养容器 | 相对表面积(相对于24孔) | 铺板培养基体积 | 质粒 DNA (ng) | dsRNA (pmol)/RNAi 载体 (ng)1 | DNA/RNA 稀释体积 (µl)2 | 脂质 (µl) 和稀释体积 (µl) |
---|---|---|---|---|---|---|
96孔 | 0.2 | 100 µl | 10-100 ng | 0.1-1 pmol/150-300 ng | 25 µl | 0.2-0.5 µl/25 µl |
48孔 | 0.4 | 200 µl | 50-100 ng | 0.5-5 pmol/150-300 ng | 25 µl | 0.3-0.8 µl/25 µl |
24孔 | 1 | 500 µl | 100-200 ng | 1-10 pmol/300-600 ng | 50 µl | 0.5-1.5 µl/50 µl |
6孔 | 5 | 2 ml | 500-1000 ng | 5-50 pmol/1.5-3 µg | 250 µl | 2.5-6 µl/250 µl |
1 dsRNA = siRNA 或 Stealth RNAi;RNAi 载体 = 含 shRNA 的质粒或含 miRNA 的质粒
2 将质粒 DNA 和 dsRNA 或 shRNA DNA 稀释于此体积的 Gibco Opti-MEM I 中。
请注意,对于强效 RNAi 分子(即诱导 > 90% 靶标敲落的 RNAi 分子),实现有效敲落所需的 dsRNA 或 RNAi 载体量可能少于表中规定的用量(建议试剂用量和体积,请参阅上文第5列)。需根据经验确定在各个细胞系中的用量。
如果需要,可进行96孔规格的筛选实验。请注意,以此规格进行筛选实验所得的结果对细胞密度、转染效率和试剂用量差异所致的孔间变异性更加敏感。如果以96孔规格转染细胞,则可能需要对转染条件进行大量优化。根据以下指南以96孔规格转染哺乳动物细胞:
1.Gitlin, L., Karelsky, S., and Andino, R. (2002) Nature 418, 430-434.
2. Yu, J.Y., DeRuiter, S.L., and Turner, D.L.(2002) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99, 6047-6052.
LT079