质粒共转染方案

介绍

Invitrogen Lipofectamine 2000 试剂采用专有配方，可促进将 Invitrogen Stealth RNA 分子、短干扰 RNA (siRNA) 或质粒 DNA 高效递送到哺乳动物细胞中进行 RNAi 分析 (1, 2)。本参考文件提供了一般指南，本节描述了使用 Lipofectamine® 2000 试剂将质粒 DNA 和 RNAi 分子（即 Stealth RNAi、siRNA、shRNA 质粒或 miRNA 质粒）共转染到哺乳动物细胞中的程序。

转染指南 

使用 Lipofectamine 2000 将目标质粒 DNA 和 RNAi 分子共转染到哺乳动物细胞时，请遵循以下一般指南。

  • 使用低传代细胞，并在转染前确保细胞健康且活细胞比例大于 90%。
  • 在达到 80-90% 融合度时转染细胞。
  • 转染时请勿使用抗生素，否则会降低转染效率并导致细胞死亡。
  • 为获得较优结果，请在形成复合物前使用 Opti-MEM I 减血清培养基稀释 Lipofectamine 2000、DNA 和 dsRNA 寡聚体。
  • Stealth™ RNAi 双链或 siRNA 通常以 20 µM 储备液形式提供。如果您以小于6孔培养皿的规格（如24孔规格）进行转染，我们推荐将 20 μM 储备液在经 DEPC 处理的水中稀释10至20倍，以制备 1-2 μM 储备液（视情况而定）。使用 1-2 µM 储备液进行转染。将 2 µM 储备液储存于 -20°C 下。

    示例：如要制备 2 µM 储备液，将2 µl 的 20 µM siRNA 或 Stealth RNAi 储备液稀释于 18 μl 经 DEPC 处理的水中。 

  • * 为提高准确度并减小检测变异性，我们推荐对各样本条件进行三次平行转染。

材料

开始前应准备好以下材料：

  • 在适当的生长培养基中培养的哺乳动物细胞系
  • 质粒 DNA（在无菌水或 TE 缓冲液中制备的 0.1-3.0 µg/µl 溶液，pH 值 8.0）
  • 目标 Stealth RNAi 或 siRNA（在 1X RNA 退火/稀释缓冲液中制备的 20 μM 储备液）或目标 shRNA 或 miRNA 表达质粒（在无菌水或 TE 缓冲液中制备的 0.1-3.0 µg/µl 溶液，pH 值 8.0）
  • RNAi 对照
  • Lipofectamine 2000 试剂（货号 11668-027 或 11668-019；储存于 +4°C 下，使用前轻轻混合）
  • Opti-MEM I 减血清培养基（预热；货号31985-062 或 31985-070）
  • 适当的组织培养板和用品 

转染实验方案

根据此程序，使用 Lipofectamine 2000 将质粒 DNA 和 RNAi 分子共转染到哺乳动物细胞中。请参阅建议试剂用量和体积中的表格，了解不同组织培养规格所需加入的适当试剂用量和体积。请记得在实验中纳入适当的阳性和阴性对照。

  1. 转染前一天，将细胞铺于不含抗生素的适量生长培养基中，如此在转染时会达到 80-90% 的融合度。
  2. 对于每份转染样本，按如下所述制备 DNA-RNAi 分子-Lipofectamine 2000 复合物：
    • 将 DNA 和 RNAi 分子稀释于不含血清的适量 Opti-MEM I 培养基中。 轻轻混合。
    • 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000，然后取适量稀释于不含血清的 Opti-MEM I 培养基中。轻轻混合，然后室温孵育5分钟。
    • 孵育5分钟后，将稀释后的 DNA 和 RNAi 分子与稀释后的 Lipofectamine 2000 混合。轻轻混合，然后室温孵育20分钟，待形成复合物。该溶液可能呈浑浊状，但这不会阻碍转染。


  3. 将 DNA-RNAi 分子-Lipofectamine 2000 复合物加入到每个含细胞和培养基的孔中。轻轻前后晃动培养板混合。
  4. 将细胞在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育，直至准备好收获细胞和检测靶基因。无需去除复合物或更换培养基；然而，可在 4-6 小时后更换生长培养基，而不会减少转染活性。

 提示：我们推荐在转染后 24-48 小时收获细胞。

建议试剂用量和体积

下表列出了以不同组织培养规格转染细胞时所需的推荐试剂用量和体积范围。作为起点，使用位于推荐范围中点附近的一定量质粒 DNA（见第4列）、dsRNA 或 RNAi 载体 DNA（见第5列）和 Lipofectamine 2000（见第7列）；然后针对您的细胞系，通过在推荐范围内改变试剂用量进行条件优化。如果希望以96孔规格进行转染，请参阅96孔规格转染指南（下一页）中的其他指南。
 
示例：我们通常使用 Invitrogen 产品（如 150 ng 质粒 DNA、5 pmol Stealth RNAi 和 1 µl Lipofectamine 2000）以24孔规格转染 GripTite 293 MSR 细胞。
 
提示：20 µM dsRNA（即 siRNA 或 Stealth RNAi）= 20 pmol/µl。

培养容器相对表面积（相对于24孔）铺板培养基体积质粒 DNA (ng)dsRNA (pmol)/RNAi 载体 (ng)1DNA/RNA 稀释体积 (µl)2脂质 (µl) 和稀释体积 (µl)
96孔0.2100 µl10-100 ng0.1-1 pmol/150-300 ng25 µl0.2-0.5 µl/25 µl
48孔0.4200 µl50-100 ng0.5-5 pmol/150-300 ng25 µl0.3-0.8 µl/25 µl
24孔1500 µl100-200 ng1-10 pmol/300-600 ng50 µl0.5-1.5 µl/50 µl
6孔52 ml500-1000 ng5-50 pmol/1.5-3 µg250 µl2.5-6 µl/250 µl



1 dsRNA = siRNA 或 Stealth RNAi；RNAi 载体 = 含 shRNA 的质粒或含 miRNA 的质粒
 
2 将质粒 DNA 和 dsRNA 或 shRNA DNA 稀释于此体积的 Gibco Opti-MEM I 中。

强效 RNAi 分子

请注意，对于强效 RNAi 分子（即诱导 > 90% 靶标敲落的 RNAi 分子），实现有效敲落所需的 dsRNA 或 RNAi 载体量可能少于表中规定的用量（建议试剂用量和体积，请参阅上文第5列）。需根据经验确定在各个细胞系中的用量。

96孔规格转染指南

如果需要，可进行96孔规格的筛选实验。请注意，以此规格进行筛选实验所得的结果对细胞密度、转染效率和试剂用量差异所致的孔间变异性更加敏感。如果以96孔规格转染细胞，则可能需要对转染条件进行大量优化。根据以下指南以96孔规格转染哺乳动物细胞：

  • 为解决由于孔间变异性导致的潜在问题，我们推荐对各样本条件进行更多平行转染；我们通常将每份样本转染到 6-7 个单独孔中。
  • 进行细胞铺板时，请确保细胞均匀分布于每个孔的表面。与其他组织培养规格一样，在达到 80-90% 融合度时转染细胞。
  • 使用上表中列出的推荐试剂用量和体积范围，并进行相应优化。
  • 我们推荐在转染后24小时收获细胞并检测靶基因。

参考文献

1.Gitlin, L., Karelsky, S., and Andino, R. (2002) Nature 418, 430-434.

2. Yu, J.Y., DeRuiter, S.L., and Turner, D.L.(2002) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99, 6047-6052.

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