protocol

介绍

Invitrogen Lipofectamine RNAiMAX 是一种专为将 siRNA 和 Invitrogen Stealth RNAi 双链体转染至真核细胞而开发的具有专利技术的制剂。Lipofectamine RNAiMAX 具有以下优势：

  • 在许多细胞类型中具有较高的转染效率，以尽可能减少来自未转染细胞的本底表达并尽可能提高敲低水平
  • 细胞毒性极轻微，可减少非特异性效应和细胞应激
  • 通常只需低浓度的 RNAi 双链体即可获得较高敲低水平，从而进一步尽可能减少非特异性效应
  • 较佳转染活性的峰较宽且细胞毒性极轻微，在此情况下尽管存在细胞密度差异、轻微移液不准确和其他变异，但仍可达到较高敲低水平

    转染指南

  • 反向转染和正向转染方案可用于大多数检测细胞系。细胞类型特异性转染方案可在我们的网站获取，也可通过技术服务部获取。
  • 我们建议使用 Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 RNAi 双链体和 Lipofectamine RNAiMAX，然后形成复合物。
  • 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
  • 检测无血清培养基与 Lipofectamine RNAiMAX 的兼容性。
  • 为评估转染效率，我们建议使用 KIF11 Stealth Select RNAi，如“评估转染效率”中所述。
  • 使用 10 nM RNAi 双链体和指定程序作为起点；如“优化转染”中所述优化转染。


方案 - 反向转染

使用此程序在 24 孔规格板中将 Stealth RNAi 或 siRNA 反向转染至哺乳动物细胞中（对于其他规格板，请参见“扩大或缩小转染规模”）。在反向转染中，在孔内制备复合物，然后添加细胞和培养基。反向转染的速度快于正向转染，是用于高通量转染的首选方法。
如“优化转染”中所述优化转染，特别是首次转染某种哺乳动物细胞系时。所有用量和体积均按每孔给出。

  1. 对于每个待转染的孔，制备 RNAi 双链体-Lipofectamine RNAiMAX 复合物，如下所示。
    • 在组织培养板孔中，用 100 µL 不含血清的 Opti-MEM I 培养基稀释 6 pmol RNAi 双链体。轻轻混匀。
    • 使用前轻轻混匀 Lipofectamine RNAiMAX，然后向每个含有稀释 RNAi 分子的孔中加入 1 µL Lipofectamine RNAiMAX。轻轻混匀并在室温下孵育 10-20 分钟。


  2. 用不含抗生素的完全生长培养基稀释细胞，使 500 µL 培养基含有适当数量的细胞，以使汇合度在铺板后 24 小时达到 30-50%。对于悬浮细胞，使用 20,000-50,000 个细胞/孔的密度。

  3. 向含 RNAi 双链体 - Lipofectamine RNAiMAX 复合物的每个孔中添加 500 µL 稀释细胞。这使得最终体积为 600 µL，最终 RNA 浓度为 10 nM。通过来回摇动平板轻轻混匀。

  4. 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 24-72 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。

评估转染效率

为在定性分析方面评估转染效率，我们建议使用 K1F11 Stealth Select RNAi（可通过我们的网站获取；对于人类细胞，寡核苷酸 HSS105842 是良好选择）。由于有丝分裂停滞，K1F11/Eg5 被敲低的贴壁细胞在 24 小时后表现出“变圆”表型（Weil, D. 等人，Biotechniques 2002，33：1244-1248）；生长缓慢的细胞可能需要 72 小时才表现出此表型。此外，还可在 48-72 小时后检测生长抑制情况。注：Invitrogen BLOCK-iT 荧光寡核苷酸（货号 2013）经优化可与 Lipofectamine 2000 配合使用，不建议用于 Lipofectamine RNAiMAX。

优化转染

为获得较高的转染效率和较低的非特异性效应，通过改变 RNAi 双链体和 Lipofectamine RNAiMAX 浓度来优化转染条件。对于 24 孔规格板，检测 0.6-30 pmol RNAi 双链体（最终浓度 1-50 nM）和 0.5-1.5 µL Lipofectamine RNAiMAX。对于延长时程实验（> 72 小时），考虑使用在铺板后 24 小时汇合度为 10-20% 的细胞密度。
注：所需的 RNAi 双链体浓度因双链体的效率而异。

扩大或缩小转染规模

为在不同尺寸的组织培养容器中转染细胞，按表中所示根据相对表面积按比例改变 Lipofectamine RNAiMAX、RNAi 双链体、细胞和培养基的用量。

培养容器
相对表面积1
铺板培养基体积
稀释培养基反向转染
稀释培养基正向转染
RNAi (pmol)
RNAi (nM)
Lipofectamine RNAiMAX2
96 孔
0.2
100 μL
20 μL
2 x 10 µL
0.12-6
1-50
0.1-0.3 µL
48 孔
0.4
200 µL
40 µL
2 x 20 µL
0.24-12
1-50
0.2-0.6 µL
24 孔
1
500 μL
100 μL
2 x 50 μL
0.6-30
1-50
0.5-1.5 µL
6 孔
5
2.5 mL
500 μL
2 x 250 μL
3-150
1-50
2.5-7.5 µL
60 mm
10
5 mL
1 mL
2 x 500 µL
6-300
1-50
5-15 µL
100 mm
30
10 mL
2 mL
2 x 1 mL
12-600
1-50
15-35 µL


¹ 表面积可能不同，具体取决于生产商。
² 如果 Lipofectamine RNAiMAX 的体积太小而无法准确分配，且不能合并稀释液，则使用 Opti-MEM I 减血清培养基将 Lipofectamine RNAiMAX 预稀释 10 倍，再分配原体积 10 倍的量（应至少为 1.0 µL/孔）。丢弃所有未使用的已稀释 Lipofectamine RNAiMAX。

用 Lipofectamine RNAiMAX 共转染 DNA 和 RNA

我们建议使用 Lipofectamine 2000（货号 11668-027）将质粒 DNA 和 Stealth RNAi 或 siRNA 共转染至哺乳动物细胞，该产品在质粒转染方面有卓越的效果。如果您想要使用 Lipofectamine RNAiMAX 进行共转染，请进行反向转染，并进行以下调整：

1：将 20 ng（对于 24 孔规格板）质粒 DNA 添加至稀释的 RNAi 双链体中。
 
2：添加细胞，使其汇合度在铺板后 24 小时达到 80-100%

13778.PPS     2006 年 8 月 4 日