Search Thermo Fisher Scientific
Lipofectamine RNAiMAX 试剂是一种专为将 Stealth™ RNAi 或短干扰 RNA (siRNA) 高效递送至哺乳动物细胞中从而进行 RNAi 分析而开发的具有专利技术的制剂。本参考文献提供了使用 Lipofectamine RNAiMAX（货号 13778-075、13778-150）将 Stealth™ RNAi 或 siRNA 转染至人脐静脉内皮细胞（HUVEC 细胞 - ATCC，货号 CRL-1730）中的建议程序。Lipofectamine RNAiMAX 的活性范围较宽，仅需进行少量优化工作即可实现较高敲低水平。
转染指南
用 Lipofectamine RNAiMAX 将 Stealth™ RNAi 或 siRNA 转染至 HUVEC 细胞时，请遵循以下重要指南：
- 对于转染 HUVEC 细胞，仅进行了正向转染检测。
- 为评估转染效率，我们建议使用 KIF11 Stealth™ Select RNAi，如“评估转染效率”中所述。
- 我们建议使用 10 nM RNAi 双链体和指定程序。然而，所选 RNAi 序列的效率、靶基因的转录速率和所得蛋白的稳定性会影响观察到的靶基因敲低程度。您可能需要调整所用 RNAi 浓度（可使用浓度范围为 1-50 nM）和检测时间（最长 72 小时），以实现极佳的靶基因敲低效果。
- 我们建议使用 Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985-062）稀释 RNAi 双链体和 Lipofectamine RNAiMAX，然后形成复合物。
- 请勿在转染期间向培养基中添加抗生素，因为这会导致细胞死亡。
- 检测无血清培养基与 Lipofectamine RNAiMAX 的兼容性。
- Lipofectamine RNAiMAX 的活性峰较宽；有关适合使用的一系列细胞密度和转染试剂体积，请参见“最大活性的可接受范围”。
开始前请准备好以下试剂：
- 在 Ham's Kaighn's Modification F12 (F12K)（货号 21127-022）中培养的 HUVEC 细胞，该培养基添加有 2 mM L-谷氨酰胺（货号 25030-081）、0.1 mg/mL 猪肠黏膜中的肝素盐（Sigma，货号 H3393）、0.05 mg/mL ECGS（内皮细胞生长添加剂；BD 货号 354006）、10% FBS（货号 16000-044）。该培养基应每 2 周新制备一次。
注：使用低代数细胞；确保转染前细胞健康且存活率超过 90%。
- 感兴趣 Stealth™ RNAi（或 siRNA）
- Lipofectamine RNAiMAX 试剂（使用前在 +4 US °C 下储存）
- Opti-MEM I 减血清培养基
- 适当的组织培养板和耗材
使用此程序在 24 孔规格板中将 Stealth™ RNAi 或 siRNA 正向转染至 HUVEC 细胞中（对于其他规格板，请参见“推荐试剂用量和体积”）。在正向转染中，在孔中对细胞进行铺板，通常在次日制备并添加转染混合物。所有用量和体积均按每孔给出。
- 转染前一天，在 500 µL 不含抗生素的生长培养基中对 35,000 个细胞进行铺板。细胞密度应使转染时汇合度为 30%-50%。
- 对于每个待转染的孔，制备 RNAi 双链体-Lipofectamine RNAiMAX 复合物，如下所示：
- 用 50 µL 不含血清的 Opti-MEM I 减血清培养基稀释 6 pmol RNAi 双链体。轻轻混匀。 注：如果 RNAi 双链体溶液的体积太小而无法准确分配（小于 1 µL），且不能合并稀释液，则使用 1X RNA 退火/稀释缓冲液（或 RNAi 双链体生产商建议的稀释缓冲液）将 RNAi 双链体预稀释 10 倍，再分配原体积适当倍数的量（应至少为 1 µL/孔）。例如，要从 20 µM RNAi 双链体储备液中获得 6 pmol RNAi 双链体，将 RNAi 双链体稀释 10 倍，使浓度为 2 µM，再分配 3 µL。
- 使用前轻轻混匀 Lipofectamine RNAiMAX，然后取 1 µL 在 50 µL Opti-MEM I 减血清培养基中稀释。轻轻混匀。
- 将稀释的 RNAi 双链体与稀释的 Lipofectamine RNAiMAX 混合。轻轻混匀并在室温下孵育 10-20 分钟。
- 将 RNAi 双链体-Lipofectamine RNAiMAX 复合物添加至含有细胞的每个孔内。这使得最终体积为 600 µL，最终 RNA 浓度为 10 nM。通过来回摇动平板轻轻混匀。
- 在 CO2 培养箱中于 37°C 下孵育细胞 24-48 小时，直至您准备好检测基因敲低效果。培养基可在 4-6 小时后更换，但这不是必需的。
评估转染效率
为在定性分析方面评估转染效率，我们建议使用 K1F11 Stealth™ Select RNAi（可通过以下网址获取：www.lifetechnologies.com/rnaiexpress；对于人类细胞，寡核苷酸 HSS105842 是良好选择）。由于有丝分裂停滞，K1F11/Eg5 被敲低的贴壁细胞在 24 小时后表现出“变圆”表型（Weil, D. 等人，Biotechniques 2002，33：1244-1248）；生长缓慢的细胞可能需要 72 小时才表现出此表型。此外，还可在 48-72 小时后检测生长抑制情况。注：BLOCK-iT™ 荧光寡核苷酸（货号 2013）经优化可与 Lipofectamine 2000 配合使用，不建议用于 Lipofectamine RNAiMAX。
最大活性的可接受范围
因为 Lipofectamine RNAiMAX 表现出的最大活性范围较宽，所以可使用一系列细胞密度和 Lipofectamine RNAiMAX 体积进行转染。在 24 孔规格板中转染 HUVEC 细胞时，适于使用 0.5-1.25 µL Lipofectamine RNAiMAX 和 30,000 - 40,000 个细胞/孔。对于延长时程实验（72 小时），考虑使用较低的细胞数量；对于短期实验（24 小时），考虑使用较高的细胞数量。
RNAi 双链体的最终浓度可能在 1-50 nM 之间变化。10 nM RNAi 双链体浓度适用于对多个靶基因进行敲低。然而，RNAi 双链体的最佳浓度将因双链体的效率而异，并应根据经验确定。
为在不同尺寸的组织培养容器中转染 HUVEC 细胞，按表中所示根据相对表面积按比例改变 Stealth™ RNAi 或 siRNA、Lipofectamine RNAiMAX、细胞和培养基的用量。
注：20 µM Stealth™ RNAi 或 siRNA = 20 pmol/µL。
培养容器 | 每孔铺板细胞数量 | 稀释培养基 | RNAi 双链体用量 | 最终 RNAi 双链体浓度 | Lipofectamine RNAiMAX2 | |||||
起点 | 可接受范围 | 反向转染(µL) | 正向转染(µL) | 起点 (pmol) | 可接受范围 (pmol) | 起点 (nM) | 可接受范围 (nM) | 起点 (µL) | 可接受范围 (µL) | |
96 孔
|
7,500
|
5,000-10,000
|
20
|
2 x 10
|
1.2
|
0.12-6
|
10
|
1-50
|
0.2
|
0.1-0.25
|
48 孔
|
15,000
|
10,000-20,000
|
40
|
2 x 20
|
2.4
|
0.24-12
|
10
|
1-50
|
0.4
|
0.25-0.5
|
24 孔
|
35,000
|
30,000-40,000
|
100
|
2 x 50
|
6
|
0.6-30
|
10
|
1-50
|
1
|
0.5-1.25
|
6 孔
|
100,000
|
90,000-120,000
|
500
|
2 x 250
|
30
|
3-150
|
10
|
1-50
|
5
|
2.5-6.25
|
¹ 表面积可能不同，具体取决于生产商。
² 如果 Lipofectamine RNAiMAX 的体积太小而无法准确分配，且不能合并稀释液，则使用 Opti-MEM I 减血清培养基将 Lipofectamine RNAiMAX 预稀释 10 倍，再分配原体积 10 倍的量（应至少为 1.0 µL/孔）。丢弃所有未使用的已稀释 Lipofectamine RNAiMAX。
LT078