Stealth/siRNA 转染实验步骤和流程- 使用 Lipofectamine 2000

小干扰RNA（siRNA）是RNAi技术中最为常用的一种手段，其在基础研究中已经发挥了巨大的作用。

对于siRNA试验，转染试剂的选择对于试验成功与否至关重要。最关键的是，应使用专门配制、输送小分子RNA的转染试剂（大部分市售的转染试剂设计用于大型质粒DNA，而不是小RNA分子）。此外，仅有部分试剂设计用于特定细胞系的转染，而多数试剂的特异性范围较广。

Invitrogen™ Lipofectamine™ 2000 采用专有配方，用于将核
酸（DNA 和 RNA）转染到真核细胞中，具有以下优势：

• 在许多细胞类型和规格（例如，96孔）中具有极高的转染效率。有关成功转染的细胞类型列表，请参阅细胞系数据库。
• 核酸-Lipofectamine 2000 复合物可直接加入到含或不含血清的细胞培养基中。
• 转染后，无需去除复合物或更换/添加培养基，但可以在 4-6 小时后去除复合物。
  

转染实验指南

• 使用短干扰 RNA (siRNA) 或 Invitrogen™ Stealth RNAi™ 转染细胞时，请遵循第2页的程序。
• 使用质粒 DNA 转染细胞时，请遵循第3页的程序。我们推荐在复合前使用 Opti-MEM I 减血清培养基（货号 31985 062）稀释 Lipofectamine 2000 和核酸。
• 转染时请勿在培养基中加入抗生素，否则会导致细胞死亡。在实验之间保持相同的接种条件。
• 检测无血清培养基与 Lipofectamine 2000 的相容性，因为一些无血清配方（例如，CD293、SFM II、VP-SFM）可能会抑制阳离子脂质介导的转染。
  

注： 如果您正在进行 RNAi 实验，请参阅 成功进行 RNAi 实验的7个步骤 获取更多提示。另请 参阅我们的 RNAi 实验方案部分。

使用此简单程序，以24孔规格将 Stealth RNAi 或 siRNA 转染到哺乳动物细胞中。所有用量和体积均以每孔计。使用此程序作为起点；按照优化 Stealth RNAi 或 siRNA 转染所述优化转染，特别是如果您初次转染哺乳动物细胞系。

1. 转染前一天，将细胞铺于 500 µl 不含抗生素的生长培养基中，如此在转染时会达到 30-50% 的融合度。注：以较低密度转染细胞可延长转染至检测的时间间隔，并且可极大程度地减少细胞
   过度生长造成的细胞活性损失。
   


2. 对于每份转染样本，按如下所述制备寡聚体-Lipofectamine 2000 复合物：
   • A. 将 20 pmol Stealth RNAi 或 siRNA 稀释于 50 µl 不含血清的 Gibco™ Opti-MEM™ I 减血清培养基中（RNA 在 Opti-MEM 中的浓度为 400 nM）。轻轻混合
     
   • B. 使用前轻轻混合 Lipofectamine 2000，然后取 1 µl 稀释于 50 µl Opti-MEM I 减血清培养基中。轻轻混合，然后室温孵育5分钟。注：在25分钟内继续执行下一步骤。
   • C. 孵育5分钟后，混合稀释后的寡核苷酸和稀释后的 Lipofectamine 2000。轻轻混合，然后室温孵育20分钟（溶液可能呈浑浊状）。
           
3. 将寡聚体-Lipofectamine 2000 混合物加入到每个含细胞和培养基的孔中。轻轻前后晃动培养板混合。

将细胞在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育 24-96 小时，直至您已准备好进行基因敲落检测。培养基可以在 4-6 小时后更换。

优化 Stealth RNAi 或 siRNA 转染
如要实现较高的转染效率和较低的非特异性效应，请通过改变 RNA 和 Lipofectamine 2000 浓度来优化转染条件。以24孔规格检测 10-50 pmol RNA 和 0.5-1.5 µl Lipofectamine 2000。根据靶基因性质，在优化条件时也可考虑以较高密度转染细胞。

如要以不同组织培养规格转染细胞，请根据相对表面积，成比例地改变 Lipofectamine 2000、核酸、细胞和培养基的用量，如下表所示。使用自动化的高通量系统时，推荐在96孔板转染中使用 50 μl 的复合体积。

注：您可通过将细胞直接铺于转染混合物中进行快速96孔板转染。在培养板中制备复合物并以两倍于基本方案的细胞密度加入细胞，体积为 100 µl。在存在复合物的情况下，细胞同样会贴壁。

¹  表面积可能因生产商而异。
²  DNA 或 RNAi 转染方案的步骤 2a 和 2b 中的稀释培养基体积。