Stealth™/siRNA Transfections Oligofectamine™

介绍

Oligofectamine™ 试剂采用专有配方，用于将寡核苷酸1和短干扰 RNA (siRNA)2,3转染到真核细胞中。 试剂配方已经过变更，旨在增强其在低温 (+4°C) 下的稳定性，同时继续提供极高的比活性和对细胞生长极低的非特异性效应。
 
在一些检测中，性能可能会增强。

转染指南
 

  1. 使用 www.lifetechnologies.com/rnai 上的程序；点击实验方案。
  2. 使用初始浓度为 200 nM 的寡核苷酸进行转染。适当的寡核苷酸浓度范围可达 50-250 nm；根据需要进行优化。实验中始终包含一个对照寡核苷酸，用于评估非特异性效应。
  3. 可能需要使用下文“优化”部分中推荐的寡核苷酸和 Oligofectamine™ 用量制备复合物。注：我们推荐在复合前使用 Opti-MEM® I 减血清培养基（货号 31985 062）稀释 Oligofectamine™ 和寡核苷酸。
  4. 在达到 30-50% 融合度时转染细胞。根据需要进行优化。在实验之间保持相同的接种条件。使用优化后传代数在 20 代以内的细胞。
  5. 转染时请勿在培养基中加入抗生素，否则会导致细胞死亡。 
  6. 为获得较优结果，请在无血清培养基中进行转染。如果需要，可以在存在血清的情况下进行转染检测。检测任何无血清培养基与 Oligofectamine™ 的相容性。  

方案

使用以下程序，以96孔规格转染贴壁的哺乳动物细胞。对于其他规格，请参见扩大转染。所有用量和体积均以每孔计。
 
  1. 转染前一天，将细胞铺于 100 µl 不含抗生素的生长培养基中，如此在转染时细胞会达到 30-50% 的融合度。

  2. 对于每份转染样本，按如下所述制备复合物：

    • 将 1 µl 的 20 µM 寡核苷酸储备液稀释于 16 µl 不含血清的 Opti-MEM® I 减血清培养基（或其他培养基）中。轻轻混合。
    • 使用前轻轻混合 Oligofectamine™，然后取 0.4-0.8 µl 稀释于不含血清的 Opti-MEM® I 培养基（或其他培养基）中，至终体积为 3 µl。轻轻混合，然后室温孵育 5-10 分钟。
    • 将稀释后的寡核苷酸与稀释后的 Oligofectamine™ 混合（总体积 = 20 µl）。轻轻混合，然后室温孵育 15-20 分钟（溶液可能呈混浊状）。

  3. 形成复合物后，从细胞中去除生长培养基，并使用无血清培养基洗涤一次。向每个含细胞孔中加入 80 µl 无血清培养基。

  4. 轻轻混合 20 µl 复合物（步骤 2c），然后加入细胞中。

  5. 将细胞在 37°C 的 CO2 培养箱中孵育4小时。

  6. 加入 50 µl 含有 3X 正常浓度血清的生长培养基，无需去除转染混合物。

  7. 在转染后 24-72 小时或根据细胞类型和靶标在适当时，进行基因活性检测。

优化转染

如要实现较高的转染效率和较低的非特异性效应，请通过改变细胞密度以及寡核苷酸和 Oligofectamine™ 浓度来优化转染条件。

扩大转染

如要以不同组织培养规格转染细胞，请根据相对表面积的比例改变 Oligofectamine™、寡核苷酸、细胞和培养基的用量，如下表所示。有关寡核苷酸转染量的更多建议，请参阅页面顶部。

培养容器
相对表面积（相对于96孔）
寡核苷酸（20 µM 储备液的微升数 [µl]）和稀释体积 (µl)
Oligofectamine™ (µl) 和最终稀释体积 (µl)
铺板培养基体积
总体积/孔
加入的含 3X 血清培养基的体积
 96孔
     1
1 µl/16 µl
0.4-0.8 µl，稀释至 3 µl
    80 µL
100 µl
    50 µL
 24孔
     5
2.5 µl/40 µl
1-2 µl，稀释至 7.5 µl
  200 µl
250 µl
  125 µl
 12孔
   10
5 µl/85 µl
1-3 µl，稀释至 10 µl
  400 µl
500 µl
  250 µl
 6孔
   25
10 µl/175 µl
2-4 µl，稀释至 15 µl
  800 µl
1 ml
  500 µl

参考文献

1.  Li, Y., et al.(2002) J. Biol.Chem.277, 11352.
 
2.  Elbashir, S.M., et al.(2001) Nature 411, 494.
 
3. Harborth, J., et al.(2001) J. Cell Sci.114, 4557.
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