制备外周血细胞用于染色体分析（植物血凝素试验）

血细胞核型分析方法用于分析染色体异常。淋巴细胞通常不会进行细胞分裂。在存在有丝分裂原时，淋巴细胞受到刺激，DNA 开始复制并进行有丝分裂。48-72 小时后，加入有丝分裂抑制剂，使有丝分裂停止在中期。经过低渗液处理、固定和染色后，可在显微镜下观察染色体，并评价是否存在异常。

步骤

1. 将约 0.5 mL 的肝素化全血转移到含 10 mL 培养基的玻璃管或塑料管中。
2. 在 37°C ，5% CO₂ 的环境中培养 72 小时。
3. 向每个培养管加入 0.5 µg/mL 的 KaryoMAX Colcemid 溶液（货号：15212012 或 15210040）。
4. 然后再培养 15–30 分钟。
5. 将培养物转移到离心管中，500 x g 离心 5 分钟。
6. 移除上清液，用 5–10 mL 的低渗 0.075M KCl（货号：10575090）重悬细胞。
7. 在 37°C 下孵育 10–12 分钟。
8. 500 x g 离心 5 分钟。
9. 去除上清液，用5–10 mL 新鲜冰冷固定剂（1 份醋酸和 3 份甲醇）。重悬细胞在 4°C 下静置 10 分钟。
10. 重复步骤 7 和步骤 8。
11. 500 x g 离心 5 分钟。
12. 用小体积（0.5–1 mL）的新鲜固定剂重悬细胞，吸取到干净的载玻片上，并让其风干。

在这个阶段，可以用 Orecin 或 Giemsa 进行染色。Giemsa 显带已成为使用最广泛的技术，实现这种染色的最常见方法是使用胰蛋白酶-EDTA (0.5%) 10X（货号：15400054）处理载玻片。

Giemsa 染色

利用酶和染色剂的染色体显带技术对确定正常和异常染色体结构至关重要。

试剂

1. Gurrs 6.8 缓冲液片剂：（货号：10582013）一片（100 mL、500 mL、1 L）（溶于蒸馏水中）
2. 0.9% 氯化钠：含 4.5 g NaCl 的 500 mL 蒸馏水
3. Gurrs Giemsa 染色剂（R66）：
   • 向 48.5 Gurrs 6.8 缓冲液加入3.0 mL Giemsa 染色剂（货号：10092013）（除非另有说明）
   • 1 mL 丙酮
   • 在科普林染色缸中混合
4. 胰蛋白酶 2.5%：
   • 2.5 mL 胰蛋白酶 (10X)（货号： 15090046）
   • 49.5 mL 0.9% NaCl
   • 在科普林染色缸中混合

器材

• 科普林染色缸或较大容器
• 镊子
• 盖玻片（24 mm X 50 mm）
• 5 mL 移液器（货号：170355）
• 1 mL 移液器（货号：170353）
• 50 mL 量筒
• 50°C 烘箱 

步骤

1. 6 个科普林染色缸用于显带
   1. 第 1 个染色缸——0.125% 胰蛋白酶/0.9% NaCl 混合物
   2. 第 2 个染色缸—— 0.9% NaCl用于冲洗
   3. 第 3 个染色缸—— 0.9% NaCl用于冲洗
   4. 第 4 个染色缸——与 Gurrs 6.8 缓冲液和丙酮混合的 Gurrs Giemsa 染色剂（R66）
   5. 第 5 个染色缸—— Gurrs 6.8 缓冲液用于冲洗
   6. 第 6 个染色缸—— Gurrs 6.8 缓冲液用于冲洗
2. 将载玻片放在含胰蛋白酶/NaCl 混合物的第 1 个科普林染色缸中，浸泡一段时间。浸泡时间可能短至10秒，也可能长至2分钟，这取决于所使用的胰蛋白酶的活性。
3. 胰蛋白酶消化后，取出载玻片，将其依次浸入 0.9% NaCl 冲洗缸中，进行冲洗。
4. 然后，将载玻片放入含 Gurrs 染色剂和缓冲液的染色缸中 5 分钟。所用染色剂的强度不同，该时间可能有所不同。
5. 染色后，从染色缸中取出载玻片，将其依次浸入 2 个 Gurrs 缓冲液冲洗缸中，进行冲洗。
6. 从最后一个染色缸中取出载玻片，风干，然后用 Cytoseal 60 盖玻片盖好。可将载玻片放入烘箱（50°C）中烘干，然后在显微镜下进行细胞中期扫描。