相关产品信息

介绍

MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒旨在利用模板 DNA，通过单一可扩展至高通量的反应，在 体外表达可溶性膜蛋白。这一通用型系统包含通过表达构建体生产目标重组膜蛋白所需的所有组分，产量范围从微克级至毫克级且用时不超过4小时。纯化后，所得重组膜蛋白可用于其他下游应用，包括生物化学表征、生物物理学表征和结构表征。

MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒有四种配置：MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒和 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒各有两种规格（20次反应，可在 20-100 次反应内扩展）。

MembraneMax™ 蛋白表达的优势

  • 可溶性和单分散性膜蛋白的生产
  • 通过无细胞表达系统得到微克至毫克级的均质膜蛋白
  • 天然膜蛋白和带标签膜蛋白的便捷纯化/富集方案
  • 表达有毒膜蛋白，这类蛋白在体内的表达较差且在基于细胞的系统中得率较低。
  • 膜蛋白的合成反应简单，很容易扩展到高通量，满足较大范围的表达需求。
  • 一整套试剂盒提供所有试剂，非常方便。

可能的应用

使用 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒表达的重组膜蛋白可在纯化后用于各种下游应用，例如结构和功能研究、配体结合、抗体生产和 X 射线晶体学研究以及使用突变蛋白进行的研究。

备注：影响蛋白得率、溶解度和功能的因素有很多。因此，您的纯化蛋白可能并非在上述所有下游应用中均适用。

系统组分

MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒的主要组分包括：

  • 含有天然 (MembraneMax™) 或多聚组氨酸标记型 (MembraneMax™ HN) 纳米脂蛋白颗粒的 MembraneMax™ 试剂，这些颗粒经过优化，使获得的目标膜蛋白得率高、稳定性提高、溶解性增强。
  • 经过优化的大肠杆菌提取物 (Zubay, 1973)，其在转录和翻译过程中提高 DNA 构建体的稳定性并提高可溶性膜蛋白的得率。
  • 由 ATP 再生系统组成的优化反应缓冲液（Kim 等人，1996；Lesley 等人，1991；Pratt，1984），为蛋白合成提供能量。
  • 含盐和其他底物（Kim 和 Swartz，1999）的优化补料缓冲液，可在蛋白合成过程中补充耗尽或降解的组分，从而提高重组膜蛋白的得率。
  • 进行蛋白合成所需的氨基酸 (–Met)
  • 甲硫氨酸单独提供，可根据需要生产标记重组蛋白。
  • 专有 T7 酶混合物，包含 T7 RNA 聚合酶及其他针对基于 T7 的 DNA 模板表达而优化的组分（Studier 等人，1990）。
  • pEXP5-CT/bR 对照质粒（表达细菌视紫红质）和全反式视黄醛（细菌视紫红质的辅因子），在比色法快速活性检测中用作膜蛋白表达的阳性对照。
  • pEXP5-NT/CALML3 对照载体，用作使用 Expressway™ 表达模块进行蛋白表达的阳性对照。

MembraneMax™ 试剂

MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒利用专有的 MembraneMax™ 试剂获得高得率的可溶性膜蛋白，该试剂是一种优化的脂-蛋白配方，与细胞膜具有类似特性，其包含采用天然配方 (MembraneMax™) 或多聚组氨酸标记型配方（MembraneMax™ HN；HN：His 标记的 NLP）的纳米脂蛋白颗粒。

NLP 是直径约为 10 nm 的圆盘状颗粒，包括一种采用专有配方的支架蛋白环，该环包被着平面 DMPC（1,2-二肉豆蔻酰-sn-丙三基-3-磷脂酰胆碱）脂质双分子层。当与 Invitrogen 的高效 Expressway™ 无细胞 大肠杆菌表达系统结合使用时，MembraneMax™ 试剂能够生产微克至毫克级的可溶性膜蛋白（Katzen 等人，2008）。

MembraneMax™ 试剂操作简便，无需任何洗涤剂或繁琐的膜囊重构，因为目标膜蛋白是在模拟的细胞周围环境中合成。此外，MembraneMax™ 试剂具有高度均匀性且结构一致，能够较大限度地减少通常在微粒体或微团中观察到的常因大小、形状和结构不一致而引起的膜蛋白聚集或成簇。当合成完成后，可以从脂质双分子层的任一侧获得目标膜蛋白。

系统工作原理

MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒结合了 Expressway™ 无细胞 大肠杆菌表达系统的便利性及 MembraneMax™ 试剂提供的细胞膜样环境。

在反应混合物中加入 DNA 模板即可启动 MembraneMax™ 蛋白合成反应。MembraneMax™ 试剂能够确保膜蛋白的正确折叠和稳定性，同时试剂盒中包含的 Expressway™ 无细胞 大肠杆菌表达系统可在由 ATP 再生反应缓冲液、氨基酸和优化的补料缓冲液（可补充蛋白合成过程中耗尽的盐、氨基酸和其他底物）组成的专有混合物中进行高水平的蛋白合成。

大肠杆菌 slyD-提取物

MembraneMax™ 和 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒随附的所有 Invitrogen Expressway™ 表达模块均包含经优化的 大肠杆菌 slyD-提取物。slyD-提取物在本手册规定的反应条件下可促进 DNA 构建体中全长活性蛋白的高得率表达。
   
如果您使用了其他 Invitrogen Expressway™ 无细胞大肠杆菌表达系统，请注意一些组分（包括随旧版 Expressway™ 试剂盒提供的 Expressway™ IVPS 大肠杆菌提取物和 Expressway™ 2.5X IVPS 反应缓冲液）包含不同的配方，可能与 MembraneMax™ 和 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒中包含的 Expressway™ 表达模块不兼容。

为获得最佳结果，请使用本试剂盒中提供的组分进行蛋白合成反应。

细菌视紫红质蛋白

嗜盐菌细菌视紫红质 (bR)（GenBank 登记号 J02755）蛋白为光驱质子泵，含有7个 α 螺旋跨膜结构域。虽然其机制不涉及 G 蛋白的激活，但在视黄醛通过席夫碱的形成与 bR 的辅因子结合袋中的 Lys-216 残基共价结合时，bR 用作视紫红质和其他 GPCR 家族成员的结构模型，在 558 nm 和 568 nm （三色）或 546 nm 和 553 nm （单体）处的紫色峰和特征性吸收峰表明 bR 正确折叠且发挥作用，因此，bR 视黄醛复合物可在使用 MembraneMax™ 试剂进行膜蛋白表达中作为理想的阳性对照。

实验概述

实验概述

下表描述了使用 MembraneMax™ 或 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒合成目标重组膜蛋白所需的主要步骤。

步骤操作
1生成 DNA 模板。
2纯化您的 DNA 模板
3纯化您的 DNA 模板
4采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法或选择其他方法分析重组蛋白
5纯化您的重组蛋白（如需要）


MembraneMax™ 试剂的选择

正确的 MembraneMax™ 试剂

正确选择 MembraneMax™ 试剂对于成功表达和纯化您的目标膜蛋白至关重要。按照以下指南选择适合您表达和纯化需求的正确 MembraneMax™ 试剂。

  • MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒：如果您希望将膜蛋白表达为含有 N 端或 C 端多聚组氨酸标签 (6×His) 或任何其他标签的融合蛋白，请使用此试剂盒。
  • MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒：如果您希望以天然状态（即未标记）表达膜蛋白，或者希望使用非 6×His 标签，请使用此试剂盒。

备注：   MembraneMax™ HN 试剂内含 6×His 标签，因此无法用于表达 6×His 标记的融合蛋白。

您可以利用串联纯化方法实现膜蛋白-NLP 复合物 100% 纯度，前提是：

  • 目标融合膜蛋白包含一个非 6×His 标签，且
  • 您使用了 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒合成您的蛋白。

MembraneMax™ 试剂选择方案

下表提供了几种假设情况，指导您选择 MembraneMax™ 试剂。此表并非包含可与 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒配合使用的亲和标签或纯化系统的详尽列表。有关 Invitrogen 的表达载体和蛋白纯化系统的更多信息，请访问 www.invitrogen.com 或联系技术支持部门

如果您的表达构建体含有……则使用……
纯化方法……
N 端多聚组氨酸标签仅限 MembraneMax™ 试剂镍螯合层析
（如 ProBond™ 或 NiNTA
纯化系统）
C 端多聚组氨酸标签
MembraneMax™ 试剂镍螯合层析

当您在多聚组氨酸标签的上游插入终止密码子时，仅使用 MembraneMax™ HN 试剂。镍螯合层析
GST 标签
MembraneMax™ 试剂
GST 亲和层析
（例如谷胱甘肽转移酶
融合蛋白纯化试剂盒）

MembraneMax™ HN 试剂
镍螯合层析或 GST 亲和
层析，或以
两种方法进行串联纯化


生成 DNA 模板

介绍

Expressway™ 表达模块随 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒提供，用于使用表达构建体合成目标重组膜蛋白。成功使用该模块需要在转录和翻译调控元件（包括噬菌体 T7 RNA 聚合酶启动子 [“T7 启动子”]、原核 Shine-Dalgarno 核糖体结合位点 [RBS]、ATG 起始密码子、终止密码子和 T7 终止子）的正确背景下添加包含目标基因的 DNA 模板。但是，如果 DNA 模板经过优化配置，则可显著提高蛋白质得率。 = 如果您希望设计自己的表达构建体，本部分将提供一般指南。

影响蛋白得率的因素

在 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒等无细胞系统中生产的蛋白得率通常取决于多种因素，例如：

  • 蛋白大小
  • 目标基因序列
  • 目标基因在 DNA 模板中相对于 T7 启动子和 Shine-Dalgarno 核糖体结合位点的定位
  • 是否以含 N 端或 C 端标签（通常添加用于检测和纯化重组蛋白）的融合蛋白形式表达
  • 优化密码子的使用情况
  • DNA 模板的质量
  • mRNA 的稳定性

本部分提供了生成具有最佳配置的 DNA 模板及纯化 DNA 模板的建议和指南。蛋白及其序列的大小将取决于您的目标基因。由于这两个因素，蛋白得率的任何变化都需要凭经验进行实验，以优化表达条件。

DNA 模板

下列 DNA 模板可用于 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒：

  • 超螺旋质粒 DNA（推荐使用，以获得最高得率）
  • 线性 DNA
  • PCR 产物

有很多表达载体或 DNA 模板可供使用。为实现正确表达，所有模板均必须包含 T7 启动子、起始密码子以及位于目标基因上游的原核 Shine-Dalgarno 核糖体结合位点 (RBS)。有关模板优化的讨论见下文。

设计自己的模板

如果您正在设计一款自己的表达构建体，我们推荐您在 DNA 模板中加入以下元件：

  • 目标基因，置于 T7 启动子和核糖体结合位点 (RBS) 的下游。目标基因必须包含 ATG 起始密码子和终止密码子。
  • T7 启动子上游序列，至少包含 6-10 个核苷酸 (nt)，旨在实现高效的启动子结合（对于线性 PCR 产物而言必需）。此序列不需要具有特异性。
  • T7 启动子下游序列，至少包含 15-20 nt，旨在形成 Studier 等人 (1990) 所述的潜在茎环结构（有关更多信息，请参见下文的 Expressway™ 兼容载体）。
  • RBS 与 ATG 起始密码子之间的序列，包含 7-9 nt，旨在实现最优的目标蛋白翻译效率。此序列不需要具有特异性。
  • 位于目标基因下游 4-100 nt 处的 T7 终止子，旨在提高转录终止效率和信使的稳定性。
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MembraneMax™ 兼容载体

最低要求

很多基于 T7 的表达载体适合用作 MembraneMax™ 试剂盒中 Expressway™ 表达模块的模板。这些载体必须至少包含 T7 启动子、RBS 和 T7 终止子，具有适当的间距和序列配置，以实现最佳蛋白表达。

以下部分包括推荐与 MembraneMax™ 试剂盒中 Expressway™ 模块搭配使用的基于 T7 的 Gateway® 和 TOPO® 克隆载体的相关重要信息。

重要信息

pEXP1-DEST、pEXP3-DEST、pEXP4-DEST、pEXP5-NT/TOPO® 和 pEXP5-CT/TOPO® 载体以及任何其他可进行多聚组氨酸标记型蛋白表达的载体系统，必须使用 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒，而不能选用 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒。任何包含 C 端多聚组氨酸标签序列的表达载体（包括 pEXP4-DEST 和 pEXP5-CT/TOPO®），仅在以下条件下适合使用 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒：

  • 不使用多聚组氨酸标签进行膜蛋白纯化，
或
  • 表达载体中的目标膜蛋白基因与多聚组氨酸标签序列之间以终止密码子相隔。

与 C 端标记的融合蛋白相比，N 端 6×His 标签在 MembraneMax™ 蛋白合成反应中的表达水平更高，因此我们建议使用 N 端 6×His 标签生成融合膜蛋白。

由于观察到 pEXP2-DEST 载体的表达水平低，因此 我们不推荐 pEXP2-DEST 载体与 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒搭配使用。

推荐的表达载体

下列表达载体可从 Invitrogen 单独购得，是适合与 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒搭配使用的理想载体。有关将您的目标基因克隆到表达载体的详细说明，请参阅您所用的特定载体的手册。有关基于 T7 的载体的更多信息，请访问我们的网站 www.invitrogen.com 或联系技术支持部门。

备注：对于适合通过 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒表达多聚组氨酸标记型重组融合膜蛋白的载体系统，相关的重要使用信息见上文。

pEXP5-NT/TOPO® 和 pEXP5-CT/TOPO® 载体

Invitrogen 提供的 pEXP5-NT/TOPO® 和 pEXP5-CT/TOPO® 载体是与 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒搭配使用的理想载体。这两种载体均包括以下特性：

  • 优化了 T7 启动子、RBS 和 T7 终止子的间距和序列，可在 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒中实现高水平的蛋白表达。
  • 与拓扑异构酶 I 适配，仅需5分钟即可将 Taq 聚合酶扩增的 PCR 产物进行高效 TOPO® 克隆，从而快速生成表达构建体。
  • 具有含 6×His 标签和烟草蚀纹病毒 (TEV) 识别位点的 N 端肽段，因此可轻松检测和纯化合成的重组融合膜蛋白（仅 pEXP5-NT/TOPO® 载体）。通过 TEV 识别位点，可在 AcTEV™ 蛋白酶介导下去除 N 端标记物，从而产生接近天然的重组蛋白，其中只有 2 个氨基酸添加到 N 端。
  • 具有含 6×His 标签的 C 端肽段，因此可轻松检测和纯化合成的重组融合膜蛋白（仅 pEXP5-CT/TOPO® 载体）。

pEXP1-DEST 载体

pEXP1-DEST 载体可在 Expressway™ 无细胞大肠杆菌表达系统中实现基于 T7 的高水平重组融合蛋白表达，并且可以与 MembraneMax™ 试剂盒配合使用。该载体包含以下元件：

  • 噬菌体 T7 启动子，能够在 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒中高效诱导目标重组膜蛋白表达
  • N 端 Xpress™ 和 6×His 融合标签，用于检测和纯化重组融合蛋白
  • 位于 T7 启动子下游的两个重组位点 attR1 和 attR2，用于目标基因从入门克隆开始进行 Gateway® 克隆。
  • 位于两个 attR 位点之间的氯霉素抗性基因 (CmR)，用于
  • 反筛选
  • 位于 attR 位点之间的 ccdB 基因，用于阴性筛选。

备注：由于观察到 pEXP2-DEST 载体的膜蛋白表达水平低，因此 我们不推荐 pEXP2-DEST 载体与 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒搭配使用。

pEXP3-DEST 和 pEXP4 载体

pEXP3-DEST 和 pEXP4-DEST 载体旨在能够使用 Expressway™ Lumio™ 无细胞表达和检测系统对 N 端和 C 端标记的重组融合蛋白进行基于 T7 的高水平表达，并且可以与 MembraneMax™ 试剂盒配合使用。这两个载体包含以下元件：

  • 噬菌体 T7 启动子，能够在 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒中高效诱导目标重组膜蛋白表达
  • N 端或 C 端 6×His 融合标签和 Lumio™ 标签，用于检测和纯化重组融合蛋白（分别为 pEXP3-DEST 和 pEXP4-DEST 载体）
  • 具有含 TEV 识别位点的 N 端肽段，可使用重组 AcTEV™ 蛋白酶轻松去除重组融合蛋白中的 N 端标签（仅 pEXP3-DEST 载体）。
  • 位于 T7 启动子下游的两个重组位点 attR1 和 attR2，用于目标基因从入门克隆开始进行 Gateway® 克隆。
  • 位于两个 attR 位点之间的氯霉素抗性基因 (CmR)，用于反筛选。
  • 位于 attR 位点之间的 ccdB 基因，用于阴性筛选。
   
重要信息

任何能够表达多聚组氨酸标记型蛋白的载体系统，必须使用 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒，而不能选用 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒。任何包含 C 端多聚组氨酸标签序列的表达载体，仅在以下条件下适合使用 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒：

  • 不使用多聚组氨酸标签进行膜蛋白纯化，
或
  • 表达载体中的目标膜蛋白基因与多聚组氨酸标签序列之间以终止密码子相隔。

纯化 DNA 模板

测序

生成 DNA 模板后，我们建议您对表达构建体进行测序，以确认是否存在目标基因以及对其方向。如果您已生成融合构建体，请验证目标基因是否位于包含相应 N 端或 C 端标签的框架内。

纯化 DNA 模板

生成 DNA 模板后，您必须先纯化 DNA，然后再进行蛋白合成反应。您可以使用多种方法纯化 DNA 模板，包括商业化的 DNA 纯化试剂盒（见下文）或 CsCl 梯度离心法。纯化 DNA 模板时，切记：

  • 请勿使用凝胶纯化法纯化 DNA 模板。因为从琼脂糖凝胶中纯化得到的 DNA 溶液会显著抑制蛋白合成反应。
  • 为快速分离高质量的纯化质粒 DNA，我们建议使用 Invitrogen 提供的 PureLink™ HiPure 质粒中提或大提试剂盒。其他商业化 DNA 纯化试剂盒也适用。
  • 为从 PCR 反应中快速分离高质量 DNA，我们建议使用 Invitrogen 提供的 PureLink™ PCR 纯化试剂盒。
  • 不建议使用醋酸铵进行 DNA 沉淀，因为任何残留污染都可能会抑制翻译。使用醋酸钠。
  • 确保纯化的 DNA 无核糖核酸酶污染。制备 DNA 时请佩戴手套并使用无核糖核酸酶的试剂。
  • 确保纯化的 DNA 不含过多的乙醇或盐，因为这两种物质都可能抑制翻译。备注：用 70% 乙醇小心地洗涤经乙醇沉淀的 DNA，去除多余的盐，并进行干燥。
  • 将 DNA 重悬于 1X TE 缓冲液或水中，终浓度至少为 500 ng/μL。

MembraneMax™ 反应条件

介绍

获得纯化的模板 DNA 后，即可使用 MembraneMax™ 或 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒合成重组膜蛋白。本部分提供了合成蛋白质的指南和标准方案。

核糖核酸酶污染会影响蛋白得率。为减少核糖核酸酶污染的机会，在进行蛋白合成反应时请佩戴手套并使用无核糖核酸酶的试剂。为去除表面的核糖核酸酶，请使用 Invitrogen 单独提供的 RNase AWAY™。

因所表达蛋白的性质和所使用的模板以及合成过程中采用的反应条件不同，膜蛋白的得率可能不同。 为获得最高的膜蛋白得率，必须优化反应条件。 

反应体积

可根据您的需求缩放蛋白合成反应的体积。对于筛选反应，标准体积为 100 μL（50 μL 初始反应体积 + 50 μL 补料缓冲液），但反应体积可降低至 25 μL 或增加至 10 mL。如需调整反应体积，请相应地调整试剂体积。您也可以使用96孔板（或任何其他孔板配置）进行高通量膜蛋白合成，并根据孔的大小适当调整反应体积。

DNA 模板量

对于 100 μL 的蛋白合成反应，使用 1 μg 模板 DNA（质粒或线性 DNA）。对于 2 mL 的反应，使用 10-15 μg 模板 DNA。为获得最佳结果，请在使用前纯化 DNA 模板。

反应容器

使用表面积足够大的反应容器，以进行适度混合。我们建议在不含核糖核酸酶的 1.5 mL 无菌微量离心管中进行 100 μL 膜蛋白合成反应。如果您需要更大的反应体积，可以使用不含核糖核酸酶的 50 mL 无菌锥形管。包括96孔、6孔或12孔未经处理培养板在内的其他反应容器也适用。

孵育条件

  • 要获得最佳的蛋白得率，至关重要的是在整个孵育阶段彻底混合反应体系。我们推荐使用设定为 1,200 rpm 的恒温混匀仪或设定为 300 rpm 的振荡培养箱。请勿使用静止型培养箱（如孵育烘箱或水浴），这会使蛋白得率降低 30-50%。
  • 在 30°C 至 37°C 温度范围内孵育蛋白合成反应。最佳温度应根据经验确定。更高的温度（即 37°C）一般有助于获得更高的蛋白得率。MembraneMax™ 试剂在 30°C 和 37°C 下均可溶解膜蛋白，但是，温度较低会降低翻译速度。
  • 您可以在补料后1.5小时孵育期间获得目标蛋白（总计2小时）。很多反应在最初一小时内得到的蛋白占总蛋白的 75%。虽然更长的孵育时间（达到4小时以上）会增加总蛋白得率，但在合成过程的反应混合物中，被膜蛋白从 NLP 双分子层中替换掉的脂质积聚，可能导致形成多分散微团。

氨基酸浓度

在蛋白合成反应中使用的氨基酸浓度范围为 1 mM - 4 mM。推荐使用的氨基酸浓度为每种 1.25 mM，但可根据合成的蛋白和您的应用进行调整（参见下文的 使用非天然氨基酸部分）。

补料缓冲液

在初始孵育30分钟后，向蛋白合成反应中加入1体积的补料缓冲液（含 Expressway™ 2X IVPS 补料缓冲液和氨基酸）。在蛋白合成反应开始后第30分钟添加半体积的补料缓冲液，在第1小时再次添加半体积的补料缓冲液，可获得更高的蛋白得率。如果您选择更长的孵育时间，则可以根据经验确定添加补料缓冲液的时间间隔。

使用非天然氨基酸

本试剂盒中单独提供甲硫氨酸，因此您可在重组蛋白中整合非天然氨基酸，也可在蛋白合成反应中调整氨基酸的浓度。基于您的具体应用，您可以选用以下类型的非天然氨基酸：

  • 放射性标记的甲硫氨酸：使用 [35S]-甲硫氨酸生成放射性标记蛋白，以用于表达和纯化研究。
  • 重金属标记的甲硫氨酸：使用硒代甲硫氨酸（Budisa 等人，1995；Doublie，1997；Hendrickson 等人，1990）生产标记蛋白，以用于 X 射线晶体学研究。

备注：关于标记型甲硫氨酸和非标记型甲硫氨酸的推荐用量，请参见 执行 MembraneMax™ 蛋白合成反应。使用硒代甲硫氨酸时，请勿在蛋白合成反应过程中使用任何非标记型甲硫氨酸。

处理试剂

  • 请勿将大肠杆菌slyD-提取物、2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）及 2X IVPS 补料缓冲液储存于 –20°C 或室温下，否则可能会导致其活性损失。
  • 大肠杆菌 slyD-提取物、2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）和 2X IVPS 补料缓冲液可冻融一次或两次。但您应当避免多次冻融循环，否则可能会导致其活性损失。您也可以将试剂分装后进行冷冻，以尽量减少多次冻融循环。
  • 虽然多次冻融循环不会影响 MembraneMax™ 试剂的性能，但仍需尽量减少冻融循环。
    
重要信息

全反式视黄醛对光敏感。虽然其包装为琥珀色玻璃瓶，但您应尽量避免其暴露于光照下，并在使用后避光保存。

阳性对照载体

MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒中包含两种阳性对照载体。

  • 其中，pEXP5-NT/CALML3 与 Expressway™ 表达模块配合使用，并表达 N 端标记的人 CALML3 蛋白。
  • pEXP5-CT/bR 与 MembraneMax™ 和 MembraneMax™ HN 表达模块配合用于快速比色对照检测，并表达细菌视紫红质。

关于对照载体的详细信息。若要增殖和维持对照质粒：

  1. 按照您所选的方法，使用 10 ng 质粒转化 recA、endA 大肠杆菌菌株（如 TOP10、DH5α™ 或等同菌株）。

  2. 在含 100 μg/mL 氨苄青霉素的 LB 琼脂平板上筛选转化体。

  3. 制备含质粒的转化体的甘油储备液，以长期储存。

MembraneMax™ 蛋白合成反应

需要的材料

  • 表达构建体或其他适用的 DNA 模板（经纯化；重悬于 TE 或水中，浓度大于 500 ng/μL）
  • 每次反应使用不含核糖核酸酶的 1.5 mL 无菌微量离心管或其他合适的反应容器。
  • 不含核糖核酸酶的移液器吸头和微量离心管
  • 恒温混匀仪（设定为 30°C 或 37°C 及 1,200 rpm）
  • 可选：标准振荡培养箱（设定为 300 rpm）代替恒温混匀仪
  • 可选：标记型甲硫氨酸（如需生产标记型重组蛋白）

随试剂盒提供：

  • MembraneMax™ 或 MembraneMax ™ HN 试剂（室温下解冻）
  • Expressway™ 大肠杆菌 slyD–提取物（在冰上解冻）
  • Expressway™ 2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）（在冰上解冻）
  • Expressway™ 2X IVPS 补料缓冲液（在冰上解冻）
  • T7 酶混合物（置于冰上；初次使用后在 -20°C 下储存）
  • 50 mM 氨基酸 (–Met)

备注：解冻 50 mM 氨基酸 (–Met) 时，溶液可能呈棕色或淡黄色。这是正常现象，不会影响氨基酸的活性。

  • 75 mM 甲硫氨酸
  • 无脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的水（随试剂盒提供）
  • 可选：  pEXP5-CT/bR 对照质粒（0.5 μg/μL TE 缓冲液，pH值8.0）和全反式视黄醛底物（10 mM DMSO 溶液）（如果进行快速比色对照反应）

缩放 MembraneMax™ 蛋白合成反应

100次反应配置的 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒中含5管相应的 MembraneMax™ 试剂以及 Expressway™ 大肠杆菌 slyD–提取物（每管 400 μL）、Expressway™ 2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）（每管 400 μL）和 Expressway™ 2X IVPS 补料缓冲液（每管 500 μL）各5管。

可在不同反应体积中合成重组膜蛋白，如用于筛选实验（即 100 μL 反应）或获得更多蛋白量（即每次反应高达 10 mL）。对于小反应体积，我们建议进行如下操作：

  1. 在冰上解冻 MembraneMax™ 或 MembraneMax™ HN 试剂、大肠杆菌 slyD–提取物、2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）以及 2X IVPS 补料缓冲液。

  2. 取蛋白合成反应所需用量的 MembraneMax™ 或 MembraneMax ™ HN 试剂、大肠杆菌 slyD–提取物、2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）及 2X 补料缓冲液，然后将管放回 -80°C 冰箱中。

执行 MembraneMax™ 蛋白合成反应

采用以下方案根据 DNA 模板合成您的重组膜蛋白。提供的量为标准 100 μL 反应用量；如需调整反应体积，则可以相应地调整试剂体积。

  1. 对于每份样本，将以下试剂加入到合适的反应容器中

    试剂 蛋白合成 Rxn 阳性对照 Rxn 阴性对照 Rxn
    大肠杆菌 slyD-提取物20 μL20 μL20 μL
    2.5X IVPS 反应缓冲液（–氨基酸）20 μL20 μL20 μL
    50 mM 氨基酸 (–Met)1.25 μL1.25 μL1.25 μL
    75 mM 甲硫氨酸*1 μL1 μL1 μL
    MembraneMax™ 或 MembraneMax™ HN 试剂2 μL2 μL--
    T7 酶混合物1 μL1 μL1 μL
    DNA 模板1 μg----
    pEXP5-CT/bR--2 μL2 μL
    无脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的水补至最终体积 50 µL 补至最终体积 50 µL 补至最终体积 50 µL


  2. 盖紧试管，放入恒温混匀仪 (1,200 rpm) 中，在 30-37°C 下孵育样本30分钟。孵育期间，将以下试剂加入各样本的无核糖核酸酶无菌微量离心管中，制备补料缓冲液。对于多份样本，您可以相应地按比例增加所用试剂的体积，并制备一份预混液。

    试剂 蛋白合成 Rxn 阳性对照 Rxn 阴性对照 Rxn
    2X IVPS 补料缓冲液25 μL25 μL25 μL
    50 mM 氨基酸 (–Met)1.25 μL1.25 μL1.25 μL
    75 mM 甲硫氨酸*1 μL1 μL1 μL
    10 mM 全反式视黄醛--0.5 μL0.5 μL
    无脱氧核糖核酸酶/核糖核酸酶的水补至最终体积 50 µL补至最终体积 50 µL补至最终体积 50 µL  


    *备注： 要使用 [35S]-甲硫氨酸生成放射性标记膜蛋白，在开始反应时加入 [35S]-甲硫氨酸和 75 mM 非标记型甲硫氨酸各 1 μL，然后在补料缓冲液中再次加入 [35S]-甲硫氨酸和 75 mM 非标记型甲硫氨酸各 1 μL。要使用硒代甲硫氨酸生成标记蛋白，仅使用 2 μL 硒代甲硫氨酸，请勿添加非标记型甲硫氨酸。

  3. 孵育30分钟后（从上述步骤2开始计），向样本中加入 50 μL 补料缓冲液（总体积 = 100 μL）。

  4. 盖紧试管，并将样本放回恒温混匀仪 (1,200 rpm)。视需要在 30-37°C 下孵育 1.5–2 小时。

  5. 将反应体系置于冰上，然后进行样本分析，或将样本储存于 -20°C 下供以后处理或分析。


优化 MembraneMax™ 蛋白合成反应

根据您的蛋白质并基于所得的初始结果，您可能需要优化 MembraneMax™ 蛋白合成反应。以下指南并非详尽列表，而是作为优化的起点，必须根据经验进行优化。反应的孵育时间可能要长于建议的2小时（至多4小时），以提高蛋白得率，但这可能导致形成多分散微团（ 孵育条件）。由于孵育2小时通常会使大多数蛋白的表达超过 75%，因此通常不需要延长孵育时间。

  • 您可以提高孵育温度以提高翻译速率，或降低温度以使蛋白质有更多时间完成正确折叠。请勿将孵育温度降至 24°C 以下，24°C 是 MembraneMax™ 试剂 DMPC 脂质双分子层的转换温度。
  • 改变反应的氧化条件也将改变其动力学。您可以通过增加或降低恒温混匀仪或振荡培养箱的速度来实现这一目的。
  • 您可以调整合成反应的补料时间。例如，您可使用 50% 的反应体积开始反应，之后加 25% 反应体积的补料缓冲液两次，每次间隔30分钟（例如：50 μL 初始反应体积 + 两次 25 μL 补料缓冲液，总反应体积为 100 μL）。在标准 MembraneMax™ 蛋白合成方案中，以最终反应体积的 50% 开始反应，30分钟后，补充 50% 总反应体积的补料缓冲液（例如：50 μL 初始反应体积 + 50 μL 补料缓冲液，总反应体积为 100 μL）。
  • 蛋白得率取决于反应体积。您可以按比例扩容反应体积，以获得更大量的膜蛋白。
  • 增加反应混合物中 MembraneMax™ 试剂的浓度无法提高蛋白得率，但是，您可以进行滴定以减少试剂用量。
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分析样本

介绍

膜蛋白合成反应完成后，您可使用任何可选方法进行样本分析。通常，MembraneMax™ 蛋白合成反应中产生的膜蛋白量足以通过考马斯染色的蛋白凝胶或通过蛋白质印迹分析法进行检测。如果您在合成过程中用  [ 35S]-甲硫氨酸示踪标记膜蛋白，则可以采用放射自显影法分析您的蛋白。或者，您可以采用酶活性检测或亲和纯化法进行更可靠的生物化学分析。

  • 随膜蛋白合成反应平行进行快速比色对照检测（见下文），以指示 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒的组分是否发挥预期作用。
  • 如果您计划使用聚丙烯酰胺凝胶电泳来分析样本，您可首先用丙酮沉淀蛋白以去除弥散背景。下文提供了丙酮沉淀方案及其他凝胶电泳一般指南。
  • 如果您使用 [35S-甲硫氨酸] 进行了示踪标记，则可使用 TCA 沉淀法测定掺入的放射性标记甲硫氨酸的量，并计算蛋白得率（参见测定蛋白得率）。

解读 MembraneMax™ 比色对照检测

在存在辅因子全反式视黄醛的条件下，正确折叠的功能性细菌视紫红质 (bR) 的成功表达能够在短短15分钟时间内使反应混合物从淡黄色变为特征性粉色。更长的孵育时间（推荐的2小时或更长时间）会产生更多的 bR 和更强烈的变色效应。有关细菌视紫红质蛋白的更多信息，请参见上文。

如果 MembraneMax™ 蛋白合成反应正确进行，则您将观察到阳性对照反应混合物中出现特征性粉色，而阴性对照混合物仍然为淡黄色。也可以通过下述任何一种方法对对照样本进行分析。

膜蛋白的表达水平可能因蛋白质而异，具体取决于蛋白质的性质、DNA 模板的配置以及 MembraneMax™ 蛋白合成反应的条件。如果您使用较小反应体积进行初步实验或筛选，可能无法在考马斯染色的蛋白凝胶上显像膜蛋白。在这种情况下，我们建议采用蛋白凝胶银染，或通过蛋白质印迹分析或放射自显影法对膜蛋白进行显像。

SDS-PAGE 分析

为便于采用 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳法分离和显像重组膜蛋白，Invitrogen 提供了多种预制 NuPAGE® 和 Novex® Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶和电泳设备，以及一系列染色试剂盒和蛋白分子量标准品，包括 Novex® Sharp™、BenchMark™ 和 HiMark™。关于订购信息。有关 Invitrogen 提供的各种电泳产品的更多信息，请访问 www.invitrogen.com 或
联系技术支持部门。

在 SDS-PAGE 分析前，您必须首先使用丙酮沉淀蛋白，以去除弥散背景。下文提供了丙酮沉淀方案及其他凝胶电泳一般指南。

SDS-PAGE 分析所需的材料

  • 丙酮（室温）
  • 1X NuPAGE® LDS 或 Novex® Tris-甘氨酸 SDS 上样缓冲液（或任何其他适用于所用凝胶的兼容性上样缓冲液）
  • 用于分离目标蛋白的适用聚丙烯酰胺凝胶
  • 适用蛋白标准品和染色剂（如 Novex® Sharp™ 蛋白标准品、SimplyBlue™ SafeStain）

备注：您也可以使用标准 SDS-PAGE 凝胶和上样缓冲液。

丙酮沉淀

在上样至聚丙烯酰胺凝胶以进行分析之前，使用以下方案沉淀蛋白。在开始此程序之前，请确保您有适合您蛋白大小的凝胶，或使用 Invitrogen 提供的预制聚丙烯酰胺凝胶。

  1. 向 20 μL 丙酮中加入 5 μL 步骤5获得的蛋白反应产物。混匀。

  2. 在室温下，使用微量离心管以 10,000 × g 离心5分钟。

  3. 小心移除上清液，注意不要扰动蛋白沉淀。

  4. 将沉淀重悬于 20 μL 1X NuPAGE® LDS 上样缓冲液中。

  5. 在 70-80°C 下加热 10-15 分钟并快速离心。

进行 聚丙烯酰胺凝胶电泳

备注：或者，可将样本储存于 -20°C 下备用。

聚丙烯酰胺凝胶电泳

  1. 取 5-10 μL 上述步骤5所得样本，上样至 SDS-PAGE 凝胶，按照生产商的建议进行电泳分析。如果需要，您也可以将样本储存于 -20°C 下以节省样本。

  2. 根据您选择的检测方法，进行以下操作：

您的目的操作
使用合适的蛋白染色剂对蛋白进行显像按照生产商的说明对凝胶进行染色。
使用 Lumio™ Green 检测试剂盒对蛋白进行显像（如果您的蛋白包含 Lumio™ 标签）按照 Lumio™ Green 检测试剂盒随附的手册中的说明进行操作（参见下文）。
采用蛋白质印迹法分析您的蛋白以电泳方式将蛋白质转移到合适的膜上，并使用合适的抗体检测所选的蛋白质（参见下文）。


备注：对于放射性标记蛋白，可将凝胶置于能够增强信号的市售试剂中以提高信号强度。干燥凝胶，并暴露于 X 射线胶片 1-4 小时。

检测融合蛋白

如果所表达的重组膜蛋白包含源于 pEXP1-DEST、pEXP3-DEST、pEXP4-DEST、pEXP5-NT/TOPO®或 pEXP5-CT/TOPO® 的融合标签，您可使用靶向表位标签的抗体进行蛋白质印迹分析并检测蛋白表达。有关抗体的更多信息，请访问 www.invitrogen.com 或联系技术支持部门。

检测 Lumio™ 标记的蛋白

如果您正在使用 pEXP3-DEST 或 pEXP4-DEST 表达载体，则可以选择表达与 Lumio™ 标签融合的重组膜蛋白，此标签是一种四半胱氨酸序列标签，可被 Lumio™ 检测试剂特异性识别和结合，因此可实时进行高灵敏度的胶内蛋白检测。有关 Lumio™ 技术的更多信息，请参阅 Lumio™ Green 检测试剂盒手册或 Expressway™ Lumio™ 无细胞表达和检测系统手册（均可在 www.invitrogen.com 上获取或联系技术支持部门）。


检测 CALML3 对照蛋白

如果在使用 Expressway™ 表达模块进行蛋白表达时将 pEXP5-NT/CALML3 用作阳性对照，您可以使用 5 μL 反应体系在考马斯染色的凝胶上检测 CALML3 融合蛋白。通常 100 μL 蛋白合成反应体系应产生至少 75 μg 19.5 kDa 融合蛋白。

pEXP5-NT/CALML3 表达的 CALML3 融合蛋白不是膜蛋白。其作为 Expressway™ 表达模块的阳性表达对照品提供。如果快速比色对照检测结果呈阳性（即反应混合物变为粉色），则无需使用 pEXP5-NT/CALML3 质粒。但是，如果阳性对照反应混合物仍呈淡黄色，您可以尝试使用 Expressway™ 表达模块表达 CALML3，以准确找出反应中出现问题的原因。

如果比色检测结果呈阴性而之后 CALML3 融合蛋白表达呈阳性，则提示 MembraneMax™ 试剂发生降解，而缺乏 CALML3 蛋白表达则表明 Expressway™ 表达模块中的试剂降解是潜在原因。

备注：正确储存时，所有 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒中的试剂可以质保6个月。


下一步操作

验证表达后，您即可将重组膜蛋白用于任何下游应用。如果您计划使用重组蛋白进行结构分析（包括 X 射线晶体学分析），请注意，您必须在使用前纯化重组蛋白。可使用任何可选方法纯化您的重组蛋白。

  • 如果您已在表达载体中带有 N 端或 C 端多聚组氨酸标签的框架内克隆基因，您可以使用金属螯合树脂（如 Ni-NTA 或 ProBond™）纯化重组融合蛋白。
  • 同样，可以通过金属螯合树脂亲和纯化法纯化天然重组膜蛋白或含有除非多聚组氨酸之外标签的重组蛋白（前提是使用 MembraneMax™ HN 试剂盒合成）。
  • 对于含有除多聚组氨酸标签之外亲和标签（如 GST 或 MBP）的重组膜蛋白，如果该膜蛋白使用 MembraneMax™ HN 试剂盒表达得到，则可采用适用的亲和层析法与金属螯合树脂（例如 Ni-NTA 或 ProBond™）串联纯化。

备注：其他金属螯合树脂也适用。

测定蛋白得率

介绍

如果您在膜蛋白合成反应中加入放射性标记的甲硫氨酸，则您可采用 TCA 沉淀法确定放射性标记的甲硫氨酸的掺入量并计算蛋白得率。

确定总计数

  1. 混匀，并取步骤5中获得的放射性标记反应体系各 5 μL，置于玻璃微纤维过滤器（GF/C 型；Whatman，货号 1822-021）中。

  2. 置于一边使其干燥。请勿洗涤或采用 TCA 沉淀法处理这些过滤器。

进行 TCA 沉淀

以下提供了两种 TCA 沉淀方案；一种是进行标准 TCA 沉淀；另一种是使用真空过滤装置（例如 Millipore 1225 取样歧管）进行 TCA 沉淀。选择最适合您需求的方案。

进行标准 TCA 沉淀

  1. 混匀，并取步骤5中获得的放射性标记反应体系各 5 μL，单独置于玻璃纤维 (GF/C) 过滤器中，使其在空气中干燥约 5-10 秒。

  2. 将过滤器置于烧杯中，并在室温条件下使用 10% 冷 TCA 洗涤一次，持续10分钟，同时轻轻振摇（每个过滤器使用约 10-20 mL）。

  3. 在室温下，用 5% TCA 洗涤5分钟，同时轻轻振摇。重复洗涤。

  4. 用甲醇冲洗过滤器，以促进干燥。

  5. 使过滤器干燥，置于闪烁瓶中，并加闪烁液。在闪烁计数器中进行样本计数。

  6. 之后计算蛋白得率。

使用真空过滤装置进行 TCA 沉淀

  1. 取“实验概述”步骤5中获得的各放射性标记反应体系等分试样 5 μL，置于单独的玻璃管中。

  2. 向各反应体系中加入 100 μL 的 1 N NaOH，并在室温下孵育5分钟。

  3. 每支玻璃管中加入 3 mL 的 10% TCA，并在 +4ºC 下孵育试管20分钟。

  4. 用 10% TCA 润湿各玻璃纤维 (GF/C) 过滤器，并置于真空过滤装置上。

  5. 开启真空，并将各玻璃管中的 TCA 溶液倒入样本孔中。

  6. 用 5% TCA 洗涤过滤器两次。

  7. 用 100% 乙醇洗涤过滤器一次。保持真空状态1分钟，使过滤器干燥。

  8. 关闭真空，并取出过滤器。将过滤器置于闪烁瓶中，并加闪烁液。在闪烁计数器中进行样本计数。

  9. 之后计算蛋白得率

计算蛋白得率

使用下列公式计算获得的蛋白得率。您需要确定特定反应中存在的甲硫氨酸的皮摩尔量 (pmole)。切记放射性标记型和非标记型甲硫氨酸均需考虑在内。您还需要采用 TCA 沉淀法测定合并的总计数（见上文）。


背景计数 =             在无 DNA 的模拟反应中获得的沉淀计数

总计数 =                                         吸取每 5 μL 试样所含 cpm 的总数×   总反应体积
                                                                                                                               5                          
                                                                                             
                                                                                                    总计数
放射性比度 =                                                                甲硫氨酸的皮摩尔量 (pmole)



甲硫氨酸的皮摩尔量 (pmole)                                  [（TCA 沉淀计数 - 背景计数）  X  总反应体积
掺入=                                                                                                                                            5
                                                                        ______________________________________________________
                                                                                                                     放射性比度



蛋白的皮摩尔量 (pmole)=                                             掺入蛋白中的甲硫氨酸的皮摩尔量 (pmole)
                                                                                        蛋白中的甲氨基酸数量

蛋白得率 (μg)=                                        蛋白的摩尔数 × 蛋白的分子量
                                                                                                                   10 6

纯化重组膜蛋白

介绍

pEXP1-DEST、pEXP3-DEST、pEXP4-DEST、pEXP5-NT/TOPO®和 pEXP5-CT/TOPO® 载体中包含 N 端或 C 端 6xHis 标签，因此可使用 ProBond™ 和 Ni-NTA 等金属螯合树脂纯化您的重组蛋白。本部分提供了纯化指南。

pEXP3-DEST 和 pEXP5-NT/TOPO® 载体包含一个烟草蚀纹病毒 (TEV) 识别位点，因此可使用 AcTEV™ 蛋白酶去除重组融合蛋白中的 N 端标签。

ProBond™ 和 Ni-NTA 树脂

ProBond™ 和 Ni-NTA 是镍荷电琼脂糖树脂，可用于以下蛋白的亲和纯化：

  • 含有 6xHis 标签的融合膜蛋白
  • 使用 MembraneMax™ HN 合成的天然膜蛋白
  • 含有除多聚组氨酸之外亲和标签的膜蛋白（前提是使用 MembraneMax™ HN 表达得到）（串联亲和纯化）

如要使用另一种金属螯合树脂纯化融合蛋白，请参阅生产商的说明。

纯化指南

遵照这些指南纯化使用 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒表达的多聚组氨酸标记型膜蛋白使用 MembraneMax™ HN 蛋白表达试剂盒表达的蛋白（天然蛋白或含有除多组氨酸之外标签的融合蛋白）。请记住遵循适用于在天然条件下纯化的标准。有关详细信息，请参阅 ProBond™ 或 Ni-NTA 手册（如适用）。

  1. 制备含有 ProBond™ 或 Ni-NTA 琼脂糖树脂的纯化柱。将树脂加入层析柱后，用4体积水洗涤，然后加入8体积的结合缓冲液（随试剂盒提供；= 50 mM NaPO4，pH值8.0；500 mM NaCl）平衡。

  2. 在室温下，以 15,000 × g 离心蛋白合成反应体系10分钟，以去除不溶性物质。

  3. 将含有可溶性蛋白的上清液加到平衡后的树脂中，并在所需温度下孵育（即批结合）30分钟。

  4. 每次使用2体积的结合缓冲液洗涤层析柱，洗涤两次。

  5. 使用2体积含 20 mM 咪唑的结合缓冲液洗涤层析柱两次。

  6. 使用含适量咪唑（例如 250 mM 咪唑）的洗脱缓冲液洗脱蛋白。

  7. 使用 SDS-PAGE 分析各组分。

  8. 如有必要，合并所需组分并进行透析。

膜蛋白合成实验范例

介绍

本部分提供了使用 MembraneMax™ 蛋白表达试剂盒进行的典型蛋白合成实验及所得结果的示例。

实验条件

在本实验中， 嗜盐菌细菌视紫红质基因（bR；GenBank 登记号 J02755）经 PCR 扩增，并经 TOPO® 克隆到 pEXP5-CT/TOPO® 中，以生成 3435 bp pEXP5-CT/bR 表达载体。

纯化后，按照上文“实验概述”，取 1 μg pEXP5-CT/bR 加入 100 μl 蛋白合成反应体系中，其中包含由 MembraneMax ™ HN 蛋白表达试剂盒（含多聚组氨酸标记型 MembraneMax™ HN 试剂）提供的组分。反应混合物含有 0.2 μCi/μL [35S]-甲硫氨酸（用于示踪标记）和 0.5 μL 10 mM 全反式视黄醛（用于比色对照检测）。作为阴性对照，使用以相同方法制备的 pEXP5-CT/bR 质粒在无 MembraneMax™ HN 试剂的 体外蛋白合成反应体系中表达 bR。

取各反应体系的 5 μL 等分试样，在 NuPAGE® Novex® 4-12% Bis-Tris 凝胶上电泳后染色（B，考马斯染色）或暴露于 X 射线胶片（C，放射自显影），同时使用 Ni-NTA 纯化系统纯化合成反应体系的其余试样，通过 SDS 电泳分离后进行考马斯染色 (D)。图 A 描述了不存在 (-) 或存在 (+) MembraneMax™ HN 试剂时的比色检测结果。

疑难解答

介绍

请查阅此部分中的信息，以解决无细胞膜蛋白表达实验中遇到的问题。

问题 原因 解决方案
蛋白得率低或为零（但对照反应体系产生蛋白）DNA 模板的配置欠佳
  • 使用推荐的 pEXP1-DEST、pEXP3-DEST、pEXP4-DEST、pEXP5-NT/TOPO®或 pEXP5-CT/TOPO® 表达载体中的其中一种，或者按照此页顶部的指南生成具有最佳配置的 DNA 模板。
  • 确保 ATG 起始密码子位于适当的表达背景中（即确认间距并置于 RBS 之后）。 
  • 蛋白与 N 端或 C 端标签的融合可能会影响 RNA 结构并降低翻译水平。尝试将融合标签移至其他末端。
 未将目标基因未克隆到带有 N 端或 C 端标签的框架内生成新的表达构建体，确保将您的目标基因克隆到带有 N 端或 C 端标签的框架内；通过测序进行确认。
 DNA 模板不纯 
  • 受到乙醇、钠盐或醋酸铵污染
  • 受到核糖核酸酶污染
  • 制备新的 DNA 模板，注意沉淀后去除过量的乙醇和/或盐。
  • 请勿使用醋酸铵沉淀 DNA。使用醋酸钠。
  • 制备 DNA 时请佩戴手套并使用无核糖核酸酶的试剂。
 使用琼脂糖凝胶纯化了 DNA 模板请勿使用凝胶纯化 DNA。请参见此页顶部的纯化指南。
 所用 DNA 模板量不足
  • 在 2 mL 蛋白合成反应体系中使用 10-15 μg 模板 DNA。
  • 如果您要表达的蛋白较大，则可将蛋白合成反应中的 DNA 模板用量增至 20 µg。
蛋白得率低或为零（但对照反应体系产生蛋白）（续）在水浴或无振荡功能的培养箱中孵育了样本请在恒温混匀仪或振荡培养箱中孵育样本
 MembraneMax™ 试剂用量不足增加反应混合物中 MembraneMax™ 试剂的用量。
 补料不足
  • 在蛋白合成开始后第30分钟，向样本中加入1体积的补料缓冲液（即，向 1 mL 样本中加入 1 mL 补料缓冲液）。
  • 分别在蛋白合成开始后第30分钟和第1小时，向样本中加入半体积的补料缓冲液（即，50 μL 样本中加 25 μL 补料缓冲液）。
 表达的蛋白较大
  • 蛋白得率可能随着蛋白大小的增加而降低；优化反应条件。
  • 在蛋白合成过程中，将孵育温度降低至 25°C-30°C。
 在将样本加到过滤器中进行 TCA 沉淀之前未混匀样本（仅限放射性标记样本）在将样本加到过滤器中进行 TCA 沉淀之前混匀样本
 蛋白发生降解
  • 将孵育时间限制在 <2小时内。
  • 尽量减少反应、分析和纯化步骤之间的处理操作。
  • 表达完成后，立即将反应产物储存在 -20°C 下。
 表达载体含有 lac 操纵序列和编码 lac 阻遏蛋白的 lacI 基因加入 IPTG 以诱导蛋白表达。
对照反应体系不产生蛋白试剂失去活性
  • 在 -80°C 条件下储存 Expressway™ 表达模块试剂。
  • 在 -20°C 条件下储存 T7 酶混合物。
  • 在冻融 Expressway™ 大肠杆菌 slyD-提取物、Expressway ™ 2.5X IVPS 大肠杆菌反应缓冲液以及 Expressway™ 2X IVPS 补料缓冲液时要小心。一次或两次冻融循环可接受。避免多次冻融循环。
  • 我们的长期稳定性研究显示 MembraneMax™ 试剂在较大温度范围内都非常稳定。
 试剂受到核糖核酸酶污染
  • 处理试剂盒中提供的试剂时，请佩戴手套，并使用不含核糖核酸酶的用品。
  • 使用 Invitrogen 提供的 RNase AWAY™ 去除表面的核糖核酸酶。
比色对照检测不产生粉色，但是已表达出蛋白。全反式视黄醛可能脱色全反式视黄醛是光不稳定性底物；请避光储存。
蛋白的生物活性低蛋白折叠不正确
  • 蛋白合成过程中，孵育温度降低至 25°C。 膜脂质成分对于膜蛋白的正确折叠至关重要。
  • MembraneMax™ 试剂可能不包含目标蛋白所需的最佳脂质成分。
 需要翻译后修饰Expressway™ 大肠杆菌 slyD-提取物不会向重组蛋白中引入翻译后修饰（如磷酸化或糖基化）
 合成的蛋白可能需要辅因子的参与才能表现出全部活性向蛋白合成反应中加入所需的辅因子。
在聚丙烯酰胺凝胶上观察到多个条带检测到支架蛋白源自 MembraneMax™ 试剂的支架蛋白在 SDS-PAGE 凝胶中以 28 kDa 条带形式迁移。
 蛋白变性时间过长向样本中加入 1X SDS-PAGE 上样缓冲液，于 70°C-80°C 下孵育 10-15 分钟，然后上样至凝胶。
 表达较大的真核膜蛋白 (>100 kDa)表达特别大的真核膜蛋白 (>100 kDa) 时可能会产生一小部分截短的产物。

使用了旧的 [35S]-甲硫氨酸（仅限放射性标记样本）使用新鲜的 [35S-]-甲硫氨酸。

1X SDS-PAGE 上样缓冲液
中的 SDS 不足
  • 使用 Invitrogen 提供的预混上样缓冲液
  • 制备含有足够 SDS 的新鲜 SDS-PAGE 上样缓冲液。
 内部 ATG 密码子位于 RBS 样序列背景中
  • 检查您的基因序列，并搜索与内部甲硫氨酸具有适当间距的潜在 RBS。
  • 使用点突变替换甲硫氨酸或更改 RBS 序列。
  • 将您的目标基因克隆到 pEXP5-NT/TOPO® 或 pEXP5-CT/TOPO® 中。
 密码子的使用存在偏差优化密码子的使用。
凝胶上出现弥散未使用丙酮来沉淀样本使用丙酮沉淀蛋白以去除弥散背景。按照方案生成 DNA 模板。
 蛋白上样量过多减少凝胶上的蛋白上样量。
 凝胶不纯净
  • 在暴露于胶片之前对凝胶进行简单清洗。
  • 如果您已用考马斯亮蓝对凝胶进行染色，使用水或 50% 甲醇、7.5% 冰醋酸使凝胶脱色 15-30 分钟，然后干燥。
  • 如果您已对凝胶进行脱色，重复执行脱色程序。
 蛋白合成反应中存在乙醇请确保在 DNA 纯化过程中去除所有残留的乙醇。
 预制凝胶过期请勿使用过期的预制凝胶。

参考文献

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A10604         版本 A    2008年6月10日