抗体技术支持—使用入门

我们的大多数抗体产品的浓度都列在产品标签和手册中。对于一抗和二抗，浓度范围为0.1至2 mg/mL，具体浓度因产品而异。大多数“预稀释”抗体的浓度范围为1-10μg/ mL；对于我们称之为“浓缩物”的产品，其浓度通常为50-500μg/ mL。对于一些产品，我们不提供浓度 — 这些产品按体积（例如，100μL）或以其他单位（例如10个印迹）包装。此外，我们也没有提供许多前Zymed^TM病理学抗体（货号以08、18或28开头）的浓度。我们的一些抗体是由未分级血清、浓缩的杂交瘤上清液或腹水样品组成的。在这些情况下，抗体浓度是未知的。对于这些产品，请遵循我们的稀释建议。 

按体积包装的抗体浓度不是商业秘密，但其单位大小是基于活性滴度而不是抗体浓度。因此，抗体浓度会有批间差异。对于按体积或其他单位销售的大多数抗体，每批中每个小瓶可以染色的载玻片或蛋白质免疫印迹的数量不会改变，因为推荐的稀释度保持不变。如果您不知道您抗体的浓度，请通过LifeScience-CNTS@thermofisher.com联系技术支持，并提供货号和批号。

以1:200稀释抗体意味着将1体积的抗体加入到199体积的稀释液中（1 + 199 = 200）。同样地，以1:1000稀释抗体意味着将1体积的抗体加入到999体积的稀释液中（1 + 999 = 1000）。假设您需要稀释度为1:200的20 mL抗体。取1 mL抗体并将其加入199 mL的稀释液中，这可能非常容易。但是，您只需要总共20 mL的稀释的抗体，因此您可以取0.1 mL（100μL）抗体并将其加入19.9 mL的稀释液中（0.1 + 19.9 = 20）。所得的溶液仍然是1:200的稀释度。如果您只需要总共2 mL的稀释的抗体，那么混合液将是0.01 mL（10μL）抗体加入1.99 mL的稀释液中（0.01 + 1.99 = 2）。所得的溶液仍然是1:200的稀释度。稀释抗体时，轻轻混合以确保溶液均匀。我们建议不要使用涡旋混合器，因为涡旋可能会导致抗体失活。

我们通常不会公开我们免疫原的氨基酸（aa）序列，也不提供任何其他特定信息。我们能提供的免疫原相关信息列于抗体手册中。我们选择不揭示大多数抗体免疫原的多肽序列，主要是因为我们不寻求对它们的专利保护。然而，技术支持可以提供免疫原在蛋白质中的大致位置（例如，在aa23和aa100之间），表位的大体位置（例如，C-或N-末端、细胞质或膜域），以及其他可提供的相关信息。 

请转到我们的一抗选择工具，然后在左侧导航窗格的“抗体类型”下选择“单克隆”或“重组”，查看我们的小鼠和其他单克隆抗体，或我们的重组ABfinity™兔单克隆抗体。

在小鼠、大鼠、仓鼠和兔中可产生单克隆抗体。首先，将抗原注入到宿主动物体内启动机体免疫应答。继而大多数操作都是在体外将来自这些宿主的脾细胞与培养的恶性骨髓瘤细胞进行融合。在融合步骤中存活下来的细胞克隆称为杂交瘤。杂交瘤因骨髓瘤特性而可以永生，且容易在培养物中繁殖。一些杂交瘤克隆因带有B细胞特性而持续合成并分泌针对单表位的遗传学同源性抗体，称为单克隆抗体。单克隆抗体与小鼠、大鼠、仓鼠和兔的天然免疫球蛋白同源，但可由杂交瘤在体外无限生产。小鼠、大鼠、仓鼠和兔源性杂交瘤是目前最常见的单克隆抗体来源，我们提供来自这些物种的单克隆抗体，可识别大量抗原。

通常，对于IgG抗体，重链约为55kDa，轻链约为25kDa。

如果要选择多克隆二抗，请使用我们的二抗选择工具。

多克隆抗体是从先前免疫的动物的血清中收获的相关抗体的混合物。血清来源的多克隆抗体几乎可以在任何哺乳动物中产生。然而，大多数多克隆抗体是在具有大量血液的动物中产生的，如山羊、兔、驴和绵羊。

多克隆抗体的替代来源是来自已经用抗原免疫的鸟类（如鸡和火鸡）的蛋黄。从蛋黄中分离的多克隆抗体属于IgY类。IgY抗体在功能上等同于来自哺乳动物的IgG抗体。

我们的大多数多克隆抗体产品来自山羊或兔血清。我们提供许多识别众多蛋白质抗原（包括磷酸化靶标）的多克隆抗体。我们的多克隆抗体也包括种类和物种特异性抗体（例如，识别来自特定物种的IgG的抗体），因此它们用作免疫检测的二抗。 

缩写PAD代表“多克隆抗体名称（Polyclonal Antibody Designation）”。PAD类似于单克隆抗体的克隆名称或编号，但它被用作多克隆抗体的唯一标识符。PAD是商定的命名系统的一部分，该系统的开发使得研究人员可以在出版物中引用抗体而无需使用货号。

是的，我们的一些未偶联抗体提供500μL的供货形式。货号为：R950-CUS（抗Myc抗体）和R960-CUS（抗V5抗体）。 

Zymed、Biosource和Caltag曾经销售的许多抗体仍然可以从我们这里购买。大多数情况下，这些产品仍然使用之前的货号。事实上，我们仍在使用这些原始供应商开发的生产方法。这意味着您所习惯的抗体规格、配方、浓度、使用指南和结果仍然与过去相同。已经停产的抗体因以下三个原因被淘汰：1）我们不希望同一种抗体有多个品牌名称；2）我们无法保证产品的可靠供应；或者3）一些抗体的年销量对我们来说太少了。如果您发现文献中引用了Zymed、Biosource或Caltag抗体，但是您不确定是否仍然可以购买，请联系技术支持：LifeScience-CNTS@thermofisher.com。如果技术支持可以肯定地识别产品，则很容易确定其是否可以购买。

二抗是针对一抗的物种的抗体。因此，您将需要在与一抗的宿主不同的物种中产生的二抗。例如，如果您的一抗为兔源性抗体，则需要在兔以外的宿主物种（例如山羊，小鼠等）中产生的抗兔二抗。

二级抗体可能过于特异（例如，仅识别一抗的一种宿主物种）或过于广谱（例如，识别完整的IgG及其任何片段）。在大多数情况下，通过细心设计实验体系并选择合适的二抗，可以克服这些限制。以下注意事项有助于选择合适的二抗：

1. 确定一抗的宿主物种（例如，小鼠抗微管蛋白）。
2. 为二体选择合适的宿主物种 — 您将需要在与一抗的宿主物种不同的物种中产生的二抗（例如，羊抗小鼠IgG）。
3. 考虑二抗的交叉反应性或特异性问题。
   • 高度交叉吸附 — 在多标记应用或使用内源性抗体样品时使用
   • 特异性 — 与一抗的正确片段、种类或链结合
4. 使用适当的检测或纯化方法。 
   • 标记 — 与正确的酶、标签或荧光团适当偶联以用于所选择的检测方法
   • 与蛋白A、蛋白G或蛋白L结合的能力 — 确保所选的二抗对上游或下游使用的分子具有足够的亲和力（如蛋白A包被的微孔板）
5. 考虑所提供的二抗的要求。
   • 供应的状态 — 无菌液体或冻干，悬浮于PBS或Tris缓冲液中，含有载体蛋白如明胶或白蛋白还是添加了蔗糖或微生物抑制剂等稳定剂

抗体的推荐使用量基于细胞或组织裂解物的蛋白质浓度。此外，用量取决于抗体来源，具体如下：对于每200-500μg细胞或组织裂解蛋白，我们建议添加1-10μg纯化的单克隆或多克隆抗体、1-5μL未纯化的多克隆抗血清、0.2-1μL腹水或20-100μL杂交瘤上清液。这些建议仅供参考，因此您可能需要根据经验优化您的IP反应，以确定产生最高产量和最低背景的抗体量。在大多数情况下，您可以通过进行SDS-PAGE，然后进行免疫沉淀物的蛋白质免疫印迹分析，以及抗原特异性抗体染色来实现这一目的。 

请记住，如果抗体在免疫组织化学或免疫荧光染色中有效，那么它可能在IP中也起作用。这是因为这些应用都基于抗体对天然蛋白质的抗原识别。判断的唯一方法是使用上面讨论的指南作为起点在IP中尝试使用抗体。

请遵循手册和产品标签提供的储存建议。浓缩的抗体可以在2-8°C条件下储存长达1个月。对于长期储存，我们建议将所有抗体等分为一次性使用的量，并在-20°C的非无霜冰箱或-80°C下保存。 避免多次冻融，因为这会降低抗体活性。不要冷冻稀释的抗体。在使用前进行最终的抗体稀释。向抗体中加入诸如甘油的稳定剂（例如，40-50％（v / v））是可行的。但是，除非我们说可以这样做，否则我们无法保证添加稳定剂的产品的性能。

建议使用非无霜冰箱储存抗体，是因为其不会经过自动除霜循环。为了使冷冻室保持无霜状态，冷冻室实际上会定期用加热线圈对其进行除霜。在除霜循环期间，冷冻室内的温度可升高至0°C及以上。如果抗体长时间储存于这些温度下，则会部分解冻。解冻大多发生在样品容器中的空气与冷冻物的表面之间的界面处。由于空气比水升温快，因此界面处的蛋白质比试管深处的蛋白质受到的影响更大。  

即使您使用的是非无霜冰箱，也应注意抗体在其中的储存位置。最好将它们存放在冷冻室温度波动最小的区域内，该区域通常位于冰箱后部的中心。不要将抗体储存在冷冻室前部附近或冰箱门的搁架上，因为每次打开冰箱门时，抗体都将暴露于室温下。同时需要确保抗体容器紧密封闭。这有助于防止抗体因升华（冰直接转化为水蒸气，从容器中逸出的）而失水。这种缓慢的过程基本上是在正常大气压下进行冻干，并且可能导致抗体损坏。

通常，抗体可以在室温下放置长达一周而不丧失活性。因此，我们的多种抗体都是在常温下运送的。但是，不推荐在室温或更高温度下长时间储存，在这种情况下我们无法保证抗体的性能。如果您还有关于抗体稳定性的其他问题，请联系技术支持LifeScience-CNTS@thermofisher.com。

牛血清白蛋白（BSA）是一种蛋白质稳定剂，叠氮化钠是一种防止细菌生长的防腐剂。添加载体蛋白和防腐剂可增加抗体的功能和寿命。含有BSA和叠氮化物的抗体可以在2-4°C下储存。

HRP受叠氮化钠抑制，因此我们的HRP偶联的抗体不含叠氮化钠。然而，我们的未偶联抗体是以含有叠氮化钠的溶液形式提供。

我们建议疏水残基占序列中所有残基的50％或更少。确保每五个氨基酸至少有一个带电残基：这通常被认为可以增强肽段的溶解度。肽段（与折叠和掩盖疏水性氨基酸的多肽相比）太小而不能折叠，因此只有少数疏水性氨基酸可使它们不溶解。 

其他指南包括： 

• 含有多个Cys、Met和Trp的肽段可能难以合成。
• 一些序列在固相多肽合成或切割中存在问题，最好避免；这些序列包括Asp-Pro序列或在合成期间在其侧链上需要庞大保护基团的氨基酸片段。
• 甘氨酸通常具有良好的抗原性，因为它只有一个氢侧链；这使其可以完全旋转。

请注意，我们提供定制抗体制备服务，包括使用我们专有的抗原分析仪和抗原制备工具。 

大多数多肽抗原的长度范围为12至16个残基，并且相对容易合成。9个残基或更短的肽段已经成为抗体制备的有效抗原，但是长于16个氨基酸的多肽可能含有多个表位并形成二级结构。超过18个残基的多肽开始出现更多的合成挑战。在合成您的多肽之前，我们建议您使用多肽序列进行BLASTP搜索。这是为了确保多肽与宿主动物中完全不相关的蛋白质中的序列不同源或相同。

请注意，我们提供定制抗体制备服务，包括使用我们专有的抗原分析仪和抗原制备工具。