ELISA 试剂盒及抗体对支持 — 入门技巧

我们提供完整的ELISA试剂盒、试剂组分和抗体对。ELISA试剂盒是完整的即用型试剂盒，包含预包被的检测板、所有缓冲液、捕获和检测抗体。大多数试剂盒以单块板子的规格提供，但有些试剂盒提供2或5块板子。试剂组分适用于需要核心试剂盒组分但更喜欢自己制备缓冲液并自己包被板子的研究人员。抗体对是配对的检测和捕获抗体，适用于需要处理大量样品的研究人员。

我们的ELISA试剂盒可分为多个不同的类型（参见 蛋白质分析手册 第35页的表2），考虑的许多因素包括：靶标蛋白质分类、灵敏度、检测方法或检测靶标蛋白的特异性磷酸化状态的能力。

• 标准的比色法ELISA试剂盒使用标准比色检测技术，具有出色的灵敏度和检测范围。典型灵敏度<10 pg / mL，标准曲线范围约为10-250 pg / mL，但有些试剂盒的范围更广。
• 超灵敏ELISA试剂盒使用标准比色检测技术，但能够检测和分析低至0.5 pg/mL的蛋白质。基于0.5-20 pg/mL的测量范围，这些试剂盒特别适用于高度稀释的样品。
• Chemi ELISA试剂盒使用化学发光检测技术获得高灵敏度（<1 pg/mL），并且灵活性高，测量范围可达0.5至2000 pg / mL。
• 磷酸化ELISA试剂盒能够特异性检测关键信号蛋白的磷酸化，且特异性极高，其通常用于补充免疫印迹的结果并提供量化数据。

设置内部对照以及空白对照和标准曲线是监测ELISA试剂盒性能的绝佳方法。内部对照是用试剂盒测量的含有已知量的分析物的样品。内部对照的一个关键指标，以及它们与标准曲线样品的区别在于，它们会尽可能地复制您实际样品的组分。这一点很重要，因为您的样品可能含有影响分析物检测的成分，而这种影响方式与试剂盒中提供的标准稀释液的影响方式不同。换句话说，内部对照可以让您确定在标准稀释液（标准曲线）和样品基质（内部对照）中检测等量的分析物是否会给出相同的结果。同样重要的是内部对照可以让您对结果的准确度充满信心。内部对照有助于确保每次检测时结果都能始终如一。

内部对照的来源之一是含有已知量的待测分析物的自然存在的样品（如血清或血浆）。这种阳性对照样品可以原样检测，或者也可以稀释至各种浓度，最好用自然存在的相同类型的阴性样品稀释。如果可以的话，最好检测至少2个内部对照。其中一个分析物的浓度通常在标准曲线的最低点和曲线的中点之间，而另一个的浓度在中点和最高点之间。有些研究人员还会检测一个浓度接近曲线中点的内部对照。

如果您无法获得自然存在的对照品，您可以自己制备。假设您要使用ELISA试剂盒（货号KHC0061）测量人血清样品中的白细胞介素-6（IL-6）。首先，您需要一些合并的正常人类血清作为内部对照的样品基质。该血清的IL-6含量最好是微乎其微（但是已知存在），或者低到无法测量。接下来，您应该使用试剂盒中提供的人IL-6标准品，将已知量的人IL-6添加到该血清中以建立内部对照。按照产品手册中的说明制备标准曲线后，将一些剩余的浓缩IL-6标准品添加到血清基质中。如上所述，如果您的ELISA微孔板中有足够的孔，您可以制备具有高和低IL-6水平或高、中和低水平的对照。

即使您的样品类型不是血清并且您也不是测量IL-6，也可按照上述通用方法使用您的目标蛋白质和样品基质制备内部对照。点击此处查找加标回收率和稀释度线性分析的有价值的资源。如果您需要更多帮助，请联系技术支持LifeScience-CNTS@thermofisher.com。

显色剂空白对照和零标准品为您的检测性能提供不同的指标。仅包含显色剂和终止液的显色剂空白对照的A ₄₅₀ 应 <0.03。显色空白对照的A ₄₅₀ 可用于调零读板仪，在任何情况下，都应使用微孔板上获得的所有其他的A ₄₅₀ 值减去该值。

如果显色剂空白对照高于~0.03，则应直接检查瓶中显色剂的颜色。颜色范围可以从透明和蓝色到透明和略显黄色。如果是更深的蓝色，那么它很可能被污染，应不再使用。最常见的污染原因是将未使用的染色剂转移回瓶中。通常应首先将显色剂转移到干净的容器中。

您使用的其他空白孔均为零标准品孔，有时称为“零孔”。您的检测中零标准品孔的A ₄₅₀ 应 <0.35，并且最好低于该值。尽管零标准品的A ₄₅₀ 值应很低，但它通常高于显色剂空白对照的A ₄₅₀ 值。它是标准曲线上的关键的第一点，因此如果零标准品的值过高，则会减少标准曲线所涵盖的动态范围。零标准的预期值见试剂盒手册，其作为典型数据的一部分提供。如果零标准品的值高于预期值，则通常表明ELISA检测存在一些其他问题。

我们强烈建议您在进行ELISA检测时，同时进检测显色剂空白对照和零标准品。由于我们建议对所有空白对照、标准品、对照品和样品进行复孔检测，因此这些空白对照仅占4个孔。如果缺少样品孔并且绝对必要，可以省去标准曲线中的最高标准品以及次高标准品孔。您仍应按照手册中的说明制备所有标准品稀释液，但不要将您省去的那些稀释液添加到微孔板中。此建议基于以下假设：样品的A ₄₅₀ 值仍将落在使用其余点绘制的标准曲线上。如果没有，那么您需要再次使用所有标准品进行分析或者稀释样品，使其落在简化的标准曲线上。

可以。但是，由于样品特性会影响您的ELISA检测结果，您需要考虑样品“基质”的影响。基质是靶标分析物所在的液体环境，其组分可影响ELISA检测的结果。特别是，含有低蛋白质浓度的样品类型通常具有最大的影响。低蛋白质样品（如脑脊液（CSF）、组织培养上清液、支气管肺泡灌洗（BAL）液和尿液）中分析物的定量结果，可能无法与我们的标准曲线得出的结果作比较。这是因为我们的标准曲线通常用基于血清的稀释液作为基质（标准稀释液）来制备。

应将蛋白质浓度较低的样品基质调整至更类似于标准稀释液。我们的研究人员发现，向低蛋白质样品中加入一种蛋白质成分，如牛血清白蛋白（BSA），并不足以完全复制标准稀释液。我们发现，血清是特别关键的成分。

对于CSF和类似的低蛋白样品类型，我们调整样品基质，使其更类似于标准稀释液。为此，我们将样品以1：4稀释（一份样品加三份标准稀释液，试剂盒中有提供）。该稀释液是合适的含血清的蛋白质基质。您也可以使用从正常供体中合并的血清代替标准稀释液。如果使用合并血清，您需要知道其中已含有的分析物的量。这样可以将适当的校正因子应用于你的检测结果。

有时您需要复制样品类型的组分，用作阴性对照或用作制备ELISA样品的稀释液。来自正常供体的合并血清或血浆，或含/不含添加血清的非条件培养基，非常易于获得。当样品是CSF时，您可能需要使用人工CSF，其组分如下：129 mM NaCl，3 mM KCl，1.25 mM NaHPO ₄ ，1.8 mM MgSO ₄ ，1.6 mM CaCl ₂ ，21 mM NaHCO ₃ 以及10 mM 葡萄糖，pH 7.4（Paris D等人（2002） Prostaglandins Other Lipid Mediat 70（1-2）:1-12 [PMID: 12428674]）。

我们建议使用ELISA试剂盒中提供的缓冲液和特定稀释液。所有这些都经过优化，可用于这些试剂盒。如果使用任何其他缓冲液或组分，我们无法保证我们试剂盒的性能与宣传中所说的一样好。此外，当您使用一种试剂盒时，请不要使用另一种试剂盒中的试剂。我们提供的许多试剂都因试剂盒甚至是批次而有所差别。如果您需要更多帮助，请联系技术支持LifeScience-cnts@thermofisher.com。

所有ELISA试剂盒均以夹心ELISA形式提供，其中捕获抗体已经包被在96孔板上。典型的检测使用生物素化的检测抗体，接着使用链霉亲和素-HRP和HRP底物。大多数试剂盒以单个96孔板的形式提供，有些试剂盒提供2个或5个96孔板。试剂盒通常包含：

• 包被捕获抗体的96孔联排板
• 蛋白质标准品
• 洗涤缓冲液，10x
• ELISA 缓冲液/稀释液，10x
• 检测抗体（大多数试剂盒中，生物素化）
• HRP试剂（HRP偶联的二抗或链霉亲和素）（100x）
• 底物（通常为TMB）
• 终止液
• 粘性封板膜

我们提供超过1000种不同的ELISA试剂盒，靶向> 800种不同的分子。您可以查看按靶标查找 ELISA 试剂盒页面。

试剂套装包含捕获抗体、检测抗体、重组标准品、HRP偶联物、TMB底物和终止液。每个套装都含有足够的试剂来处理五个96孔板。试剂套装包含在 ELISA试剂盒 的主列表中（通过“试剂套装”搜索）。

抗体对试剂盒包含捕获抗体、检测抗体、重组标准品和HRP偶联物。每个套装都含有足够的试剂来处理四十个96孔板。可查看按靶标提供的抗体对试剂盒列表。

每个抗体对试剂盒包含捕获（包被）抗体、生物素化检测抗体、重组标准品和链霉亲和素-HRP。其他试剂列于试剂盒中的抗体对手册中，也可单独购买（抗体对缓冲液试剂盒，货号CNB0011；5X检测缓冲液，货号DS98200等）。该手册还提供了一个特定的程序，并说明了遵循特定程序时可以获得的标准曲线的示例。 

程序概述总结如下：

1）使用稀释的捕获（包被）抗体将微孔板在2-8℃下包被过夜；冲洗微孔板。

2）在包被的微孔板中孵育标准品或样品；冲洗微孔板。

3）在板中孵育稀释的生物素化检测抗体；冲洗微孔板。

4）将链霉亲和素-HRP在微孔板中孵育15-45分钟；冲洗微孔板。

5）使用TMB底物将微孔板孵育10-60分钟，然后用终止液终止反应。

6）在450nm处读取微孔板。

我们建议测定各种应用的最优缓冲液配方、浓度和孵育时间。

在人类IgG亚类ELISA试剂盒（货号99-1000）中，所提供的8联管的所有孔都包被山羊多克隆抗FITC抗体，用作一般捕获试剂。当您将单独的FITC标记的亚类特异性单克隆抗体添加到孔中时（手册第2页的检测程序中的步骤2），它们会与山羊捕获抗体结合。ELISA夹心的第二层会执行亚类特异性捕获功能。当您向孔中添加样品（即血清、标准品和对照品）时，样品中存在的任何人类IgG将与借由标记的FITC被捕获至板子上的亚类特异性抗体结合。通过试剂盒中提供的这些亚类特异性的小鼠抗人类IgG抗体的单克隆抗体实现亚类特异性检测。在将HRP标记的抗人类IgG抗体和TMB显色剂添加到孔中后，会发生真正的亚类检测。每个IgG亚类的量在其自己的孔中单独测定。

这些亚类特异性组的一个示例见手册第2页的检测程序的步骤1。在这个例子中，所示的设置是针对IgG1的，但假如说您只想测量IgG4，您也可以遵循相同的设置。不同的是，不要将小鼠抗人类IgG1抗体上样到这些孔，而是使用小鼠抗人类IgG4抗体代替。如果您只想检测IgG4，则板中的其余孔可用于其他样品，而不是用于其他亚类的标准曲线和各自的样品。但是，我们建议您每次进行检测时，在您准备的每个微孔板上检测目标IgG亚类的标准曲线。

试剂盒中的对照品由冻干的人血清组成，并且所提供的人类IgG标准品包含所有四个亚类，其浓度在批次特定的手册中显示。即使您可能只想测量1个或2个亚类，您也将使用包含所有亚类的标准品。如果您只检测1个亚类如 IgG3，其他3个亚类也不会干扰IgG3的检测，因为捕获抗体具有IgG3特异性。试剂盒中的检测抗体是抗人类IgG的HRP偶联物，其同样有效地检测所有亚类并检测孔中捕获的所有人类IgG。 

请注意，试剂盒中的抗体包被板是可以分拆为8孔联管使用的。您不必一次检测整个微孔板或两块板。将任何未使用的8孔联管储存于2-8°C并使其保持干燥。应牢固密封单个联管中未使用的孔，以防止水分在检测时进入。

在人类IgG亚类ELISA试剂盒（货号99-1000）中，部件号50270HK、50271HK、50272HK和50273HK是分别具有克隆编号HP6069、HP6002、HP6047和HP6023的单克隆抗体。这些抗体是我们引用的IUIS / WHO研究中提到的克隆（Jefferis R等人（1985）Immunol Lett 10：223-252 [PMID：3899923]）。HP6069是对人类IgG1 Fc具有100％特异性的IgG1κ；它的pI为6.4（6.3-6.8）。HP6002是对人类IgG2 Fc具有100％特异性的IgG1；它的pI为7.1（6.8-7.4）。HP6047是对IgG3铰链区具有100％特异性的IgG1；它的pI为6.6（6.5-6.7）。HP6023是对人类IgG4 Fc具有100％特异性的IgG3κ，但它与IgG3有约18％的交叉反应；它的pI为7.7（7.5-7.9）。在货号99-1000中，所有这些小鼠抗人类IgG亚类抗体都用FITC标记，这是捕获步骤所必需的。

这些亚类特异性抗体中，有三种作为独立的未标记产品出售：货号A10630（HP6069）、货号05-3500（HP6002）和货号05-3600（HP6047）。克隆HP6023仅提供生物素化（货号MH1542）及HRP偶联（货号MH1742）两种形式。

在人类IgG亚类ELISA试剂盒（货号99-1000）中，人类IgG亚类标准品是部件号50287HK。每批50287HK根据名为67/97的WHO参考标准进行校准。关于该标准的更多细节见Klein F等人（1985）Clin Chem Acta 150（2）：119-127的摘要。 

不适用。一位客户在2014年初通知了我们货号99-1000未检测到食蟹猴的IgG亚类。就其他非人类灵长类动物而言，我们确认该试剂盒是否适用于这些动物的样品。

两种类型的ELISA试剂盒均可在塑料96孔板的孔内捕获总蛋白，无论其磷酸化状态如何。这通过用“泛抗体”包被孔来完成，这种“泛抗体”不区分蛋白质的磷酸化形式和非磷酸化形式，并且不阻断待研究的磷酸化位点。此外，磷酸特异性ELISA试剂盒可对在一种或多种特异性氨基酸上磷酸化的相同蛋白质进行定量。这一检测不使用第二泛抗体，而是使用特异性识别蛋白质被特异性磷酸化时才存在的表位的抗体（即，抗体具磷酸特异性）。 

我们建议使用相同的样品同时检测总ELISA和磷酸特异性ELISA。如果无法做到这一点，请务必尽快用两个试剂盒测试相同的样品。

我们的总ELISA的结果以pg / mL表示，或者有时以ng / mL表示。该测量通常以质量单位给出，因为绘制标准曲线时使用的是已知质量的标准品。磷酸特异性ELISA的结果以“单位”表示，我们没有将其与特定的蛋白质质量相关联。我们使用单位，是因为在磷蛋白标准品的特定制剂中，难以精确地知道特定磷酸化反应的效率，因此难以精确地知道磷酸化蛋白与未磷酸化蛋白的比例。磷酸化单位对于每种磷酸特异性ELISA都是不同的，并且在每个试剂盒随附的产品手册中有描述。 

例如，典型的单位描述是“1单位=源自300pg自动磷酸化FAK蛋白的FAK [pY397]的量”。由于不能保证我们的标准制剂中的FAK是100％磷酸化的，因此我们不会声明这相当于300 pg的磷酸化FAK。相反，我们验证了大批磷酸化蛋白质，并用它来开发我们原始检测的单位定义和标准曲线。我们的蛋白质标准品的后续制剂被归一化为蛋白质的原始批次，以确保我们的单位定义在批次之间保持不变。

为了评价磷酸化水平，我们报告了蛋白质磷酸化的比较水平，以“磷蛋白单位/pg或ng总蛋白”为单位。总ELISA试剂盒量化每个样品的蛋白质质量，磷酸特异性ELISA试剂盒以单位量化该蛋白质的磷酸化水平。然后即可确定各种样品的磷酸化水平（例如，以“单位/ pg”为单位）是相似还是不同。

示例：测试两个样品的总CREB和CREB [pS133]

样品1的结果：总ELISA检测（KHO0231）显示样品中的CREB为100pg / mL。磷酸特异性ELISA（KHO0241）显示CREB [pS133]为50单位/ mL。在此样品中，CREB在丝氨酸133处被磷酸化至（50单位/ mL）/（100pg / mL）= 0.5单位/ pg总CREB的水平。

样品2的结果：总ELISA检测显示样品中的CREB为95 pg / mL。磷酸特异性ELISA显示CREB [pS133]为5单位/ mL。在此样品中，CREB在丝氨酸133处被磷酸化至（5单位/ mL）/（95 pg / mL）= 0.053单位/ pg总CREB的水平。当您将样品1与样品2进行比较时，您会看到CREB1在丝氨酸133处的磷酸化水平差异为10倍，即使总CREB蛋白几乎没有变化。

我们的磷酸特异性ELISA试剂盒具有几个优点，包括易用性和较高的灵敏度。磷酸特异性ELISA试剂盒的灵敏度通常比蛋白质免疫印迹高2-10倍，因此它们特别适用于检测“低表达”蛋白质或小样品量。此外，通过使用试剂盒中提供的重组标准品，磷酸特异性ELISA可在无需进行光密度测定的情况下提供量化的结果。