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首先，确定您是在无血清条件下进行染色的。因为血清具有酯酶活性，会过早的裂解这些染料上的AM基团，进而阻止其进入细胞。染色之后即可将细胞移回含血清培养基中。除此之外，您可以尝试增加浓度和标记时间以获得更高的强度的信号。
Qtracker™ 细胞标记试剂经内吞作用被细胞摄取并被隔离于核内体。这使得标记呈点状或囊泡状。这个是正常的，没有办法使其在整个细胞质中均匀出现。
因为这些染料嵌入了脂质膜，任何膜的干扰都将导致染料流失。这包括被像Triton™X-100去垢剂或是像甲醇的有机溶剂通透。通透是胞内抗体标记所必需的，它会导致染料流失。相反，类似于CFDA SE的活性染料应该应用于和细胞组分的共价连接，这样会在固定和通透时更好的保留染料。
Calcein AM扩散到细胞中，“AM”部分由细胞酯酶裂解，随后染料分子的荧光信号可以在细胞质中被观测到，但其不结合到细胞组分。这意味着它们能够为“整个细胞”染色。这也意味着染料不能通过醛类固定剂进行交联，因此染料会在固定时丢失。此外，质膜的任何干扰（例如去垢剂或胰蛋白酶处理）都会导致染料从细胞中渗漏。
一种可能性是染料之间的光谱渗漏。务必通过在绿光下成像红色细胞，在红光下成像绿色细胞的方式检查单色样品，对其他颜色使用最佳成像设置。如果您在对照中看到这些渗漏，那么就需要减少染料标记浓度以降低染料的亮度，或者选择那些光谱相距较远的染料。如果不是渗漏的问题，另一种可能性是细胞在染色后没有充分清洗，使得一些未结合的染料残留下来，这些染料进入后会标记其他细胞。延长清洗次数和时间应该会有帮助。
仅限研究用途，不可用于诊断操作。