细胞活力、增殖、冻存及细胞凋亡支持 – 问题排查

台盼蓝染料接触光线后可能会降解，这些污染物可能会促进形成沉淀。经过冷藏或冷冻后，台盼蓝也可能形成橙/红纤维状聚合物。 

很遗憾，这个问题没有确切的答案。非细胞透过染料的吸收速率取决于细胞类型、健康状态、营养物、吞食活力等。  

可以。alamarBlue™试剂经过多次冻/融仍可保持稳定。使用之前，务必在37°C下水浴加热并混合均匀，确保溶液均质。 

室温条件下（~22°C），试剂至多可稳定保存12个月。 

由于指示剂是一种多组分溶液，我们建议将冷冻的alamarBlue™试剂加热至37°C，并振荡或漩涡，确保所有的组分都溶于溶液中。 

试剂遇光可能会分解。务必在避光条件下储存alamarBlue™试剂，且不要长时间将试剂直接暴露于光照下。 

我们建议增加细胞在alamarBlue™试剂下的孵育时间，更改仪器的增益或电压设置，检查仪器的滤光片/波长设置。务必在实验设计时安排一个阳性对照（未处理的活细胞）组。  

请缩短孵育时间和/或减少实验所用的细胞数量。 

可能的原因之一是您的alamarBlue™试剂中的染料已经沉淀，导致染料浓度变化。这种情况下，应将试剂加热至37°C，然后振荡或漩涡，确保所有的组分都溶于溶液中。另一个原因是移液问题。请确保你的移液器经过校准且吸液前枪头固定牢固。 

可以。PrestoBlue™试剂经过多次冻融之后仍可保持稳定。使用之前，请务必在37°C下水浴加热至并混合均匀，确保溶液均一。 

在室温条件下（~22°C），试剂最多可稳定储存12个月。 

由于指示剂是一种多组分溶液，我们建议将冷冻的PrestoBlue™试剂加热至37°C，振荡或漩涡，确保所有组分都溶于溶液中。 

试剂遇光可能分解。务必在避光条件下储存PrestoBlue™试剂，且不要长时间将试剂直接暴露于光照下。 

我们建议增加细胞在PrestoBlue™试剂中的孵育时间，更改仪器的增益或电压设置，检查仪器的过滤器/波长设置。务必在实验设计时安排一个阳性对照（活细胞）组。  

请缩短孵育时间和/或减少实验所用的细胞数量。 

可能的原因之一是您的PrestoBlue™试剂中的染料已经沉淀，导致染料浓度变化。这种情况下，应将试剂加热至37°C，然后振荡或漩涡，确保所有的组分都溶于溶液中。另一个原因是移液问题。请确保你的移液器经过校准且吸液前枪头固定牢固。 

以下为有助于实现均一染色，明亮、清晰的亲代增殖峰的建议：

• 临使用前，使用试剂盒附带的DMSO或高质量无水DMSO溶解CellTrace™染料储备液，获得最佳的反应活性和细胞透性。
• 在PBS或其他无胺、无蛋白生理学缓冲液染色，不要在培养基中染色。
• 从单细胞悬液开始染色，并在染色过程中轻轻摇动细胞。
• 通过在冷的培养基中孵育细胞5分钟，快速去除未结合的染料，之后用预热培养基洗涤洗细胞两遍。 
• 在检测体系中引入死细胞染料，并仅对活细胞设门限。 
• 尽可能多地分析每个样品中的细胞。
• 流体动力聚焦细胞流式细胞仪使用低的流动速率。 
• CellTrace™染料最好的染色浓度通常介于1-10 µM之间，但针对某些类型细胞的最佳浓度会存在差异。观察不同稀释度的染色剂的染色结果，确定您的细胞最适宜的染色浓度。
• 某些类型的细胞吸收染料后的染色强度分布范围较广。如果您的细胞也是这种情况，则需要首先分选染色的未刺激亲本细胞，从而选择出一个窄的峰分布  

我们提供小份的CellTrace™试剂，强烈建议您丢弃任何未用的DMSO染料储液。CellTrace™试剂有乙酰酯基团，可以覆盖染料的电荷使得它们可以透过细胞，并且琥珀酰亚胺酯胺反应分子允许共价结合到细胞组件，可长时间滞留。如果储存环境中中含有水，乙酰酯和琥珀酰亚胺酯都易于水解。DMSO是吸水性的，因此极易从大气中吸收水。如果您必须要储存自己的染料储备液，需要使用高质量的无水DMSO储液（且不能经常打开），并将小瓶密封放置于密封的含有干燥剂的地方，尽可能保持DMSO/染料储液干燥。 

click反应在叠氮化物和炔烃类间是非常有选择性的。生物体系不可能有其他副反应。任何非特异性本底都是由于染料和多种细胞组件的非共价结合造成的。在click反应后，Select FX™信号增强剂在减少染料非特异性电荷连接方面的作用失效；我们不推荐将其与Click-iT™检测试剂一同使用。减少本底干扰的最佳方法是增加BSA洗涤的次数。您应始终在同等的处理和检测条件下做无染料或无click反应对照，以证实本底确系染料而非自发荧光所致。此外，您还可在无EdU 或无-EU，仅含溶剂的对照样本上进行完整的click反应，验证click反应信号的特异性。 

• 当铜离子在合适的化合价时，点击反应才有效。除了DIBO炔烃-叠氮化物反应外，在缺乏铜离子的条件下，叠氮化物和炔烃不会相互反应。确保在制备之后、二价铜浓度最高时，立即使用点击反应混合物。 
• 不要使用已经变黄的添加剂缓冲液；其必须无色状态下才有活性。  
• 细胞需要充分固定和通透，确保click试剂能充分接触到细胞内已掺入click底物的成分。 
• 部分试剂能结合到铜离子上，并减少其足以催化点击反应的有效浓度。click反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入任何金属螯合剂（例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等）。避免缓冲液和试剂中引入其他可能被氧化或还原的金属离子。进行click反应前，可能需要向细胞或组织样品加入额外的洗涤步骤。 
• 你可以用新鲜的实验试剂重复click反应尝试提高信号。增加click反应的时间长于30分钟不会提高低的信号。用新鲜的click反应试剂进行第二次30分钟培养在提高标记上更加有效。 
• 低信号同时也可能是因为EdU、EU和其他click底物的掺入水平较低。如果无法进行充分交联或使用的固定剂有误，其他掺入到细胞组件的click底物（如AHA、HPG、棕榈酸、叠氮化物等）可能会丢失。对于掺入到细胞膜或脂质的click底物，应避免使用乙醇或丙酮固定剂和透化试剂。 
• 在click反应时，掺入的click底物必须可被接触；相比于变性蛋白，天然蛋白中掺入的氨基酸模拟物的标记水平可能更低。 
• 你可能需要优化代谢标记条件，包括模拟物孵育时间和浓度。健康的、传代数不高、不太密集的细胞可能更容易掺入模拟物。如果孵育时间达到关注的细胞数目翻倍的时间，则应在多个整倍时间点设置包含额外剂量的click底物的阳性对照。 

click反应中的铜离子使得DNA少量变性（虽然没有BrdU检测所需要的程度），这会影响到包括DAPI和Hoechst™染色剂在内的DNA染料的结合亲和力。这种影响只会在传统的EdU试剂盒中出现，而Click-iT™ Plus EdU试剂盒由于采用的铜离子浓度低，不会出现这种现象。 

使用胰蛋白酶消化或机械刮擦细胞暂时破坏质膜，使得膜联蛋白V结合到细胞膜胞内面上的磷脂酰丝氨酸，导致假阳性染色。胰蛋白酶消化/机械刮擦后，让细胞在最佳的细胞培养条件和培养基中复苏约30分钟，从而在染色前恢复细胞膜完整性。对于轻微粘连细胞系，例如HeLa和NIH 3T3，还可使用无酶处理方法，例如使用Gibco™ 细胞溶解缓冲液（货号13151014）  

click反应在叠氮化物和炔烃类间极具选择性。生物体系不可能有其他副反应。任何非特异性背景都是由于染料和多种细胞内组分的非共价连接。Select FX™信号增强剂在click反应后减少染料的电荷为基础的非特异性连接方面效果不明显；我们不推荐将其与Click-iT™检测试剂一同使用。最佳的减少背景的方法是增加BSA清洗的次数。你应该在同样的过程和检测条件下做无染料或无click反应对照，以证实背景确实是由于染料而不是自发荧光。你同时应该在无TdT酶的对照样品进行完整的click反应来证实click反应信号的特异性。 

• 当铜离子在合适的化合价时，点击反应才有效。除了DIBO炔烃-叠氮化物反应外，在缺乏铜离子的条件下，叠氮化物和炔烃不会相互反应。确保在制备之后、二价铜(II)浓度最高时，立即使用点击反应混合物。 
• 不要使用已经变黄的添加剂缓冲液；其必须无色状态下才有活性。  
• 为确保TdT酶和点击反应试剂能够到达核内，细胞需要充分地固定和通透。为确保有足量的TdT能进入，组织样品需要用蛋白酶K或其他蛋白水解酶消化。
• 部分试剂能结合到铜离子上，并减少其足以催化点击反应的有效浓度。click反应前，不要在任何缓冲液或试剂中引入任何金属螯合剂（例如EDTA、EGTA、柠檬酸盐等）。避免缓冲液和试剂中引入其他可能被氧化或还原的金属离子。进行click反应前，可能需要向细胞或组织样品加入额外的洗涤步骤。 
• 您可以用新鲜的试剂再次进行点击反应，从而提高信号。将点击反应的时间延长至超过30分钟，并不会提高信号。用新鲜的点击反应试剂再次进行30分钟的孵育，可更有效地提高标记效率。 
• 自己的细胞可能没有凋亡。准备一份DNase I处理的阳性对照，验证TdT酶反应和点击标记反应是否正确进行。