昆虫细胞培养支持 - 入门

请参见下列关于细胞，培养基与细胞大小的列表：

对于培养快速生长和良好活性的细胞来说，有三个主要的关键因素,那就是孵育温度，换气和细胞接种密度。为了成功培养快速生长的昆虫细胞并获得良好的细胞活性，下列表格为不同种类的昆虫细胞提供了温度，接种密度和换气系统条件。 3-4天传代培养规划的悬浮培养参数

3-4天传代培养规划的贴壁培养参数

贴壁与悬浮培养推荐的换气条件

在转染和噬斑实验之前，细胞需要均匀地分布于组织培养板表面。这一操作能够确保：

• 细胞不会分布不均匀而导致形成不对称的单层细胞。
• 为转染操作提供最大的细胞表面积。

为了使细胞尽可能分散：

1. 用手前后缓慢振荡培养瓶或平板，之后左右振荡。
2. 重复以上操作四次，仔细查看以确保液体到达生长表面的所有区域。
3. 请勿通过环状摇动来分散细胞，因为这将导致细胞聚集在平板边缘周围，而非均匀分布。

不需要，昆虫细胞培养不需要CO₂交换。

请参见悬浮培养状态下的健康Sf21昆虫细胞的相差成像照片。在振荡培养瓶中将细胞以3×10E5活性细胞/mL的接种密度培养于Sf-900™ II SFM培养基中，并将振荡培养瓶孵育于28°C非加湿型的环境空气调节培养箱。该图像是使用10X和20X物镜（分别为图A和图B）在接种三天后拍摄的。 

之后的相差图像展示的是培养于Sf-900™ II SFM 培养基中以单层贴壁细胞形式生长的Sf21昆虫细胞。这些细胞是以5 × 10E4活性细胞/cm²的密度种植于T-25培养瓶中，并在28°C，非加湿型的环境空气调节培养箱中生长为单层细胞。该图像是使用10X和20X物镜（分别为图A和图B）在培养7天后拍摄的，此时培养物细胞长满。

请参见下列图像中生长于Express Five™ SFM培养基中的High-Five™细胞（培养至第3天）。

请参见下方图像中悬浮生长于Drosophila-SFM培养基中的D.Mel 2（Schneider S2）细胞（培养至第2天）。

不可，我们不推荐这样做。长期暴露于29°C以上的温度会导致细胞死亡。这些细胞最好生长于27°C或室温条件下。

我们推荐采用Sf9或Sf21细胞进行重组病毒的转染，纯化和扩增操作。Sf9细胞的大小比较规则，易于操作，并能够生长为适于噬斑测定的优良单层细胞。Sf9与Sf21细胞也可用于重组蛋白的表达，不过使用High Five™细胞系可能会获得更高的产量。 

我们推荐使用High Five™细胞系来表达分泌型重组蛋白。它们适于在无血清培养基中悬浮培养，可高水平表达的重组蛋白（Davis et al., 1992）

注意：一般来说，在优化蛋白表达情况之前，使用一种细胞系进行表达尝试比较方便。一旦您确定了您的重组蛋白已成功表达，即可尝试使用其他细胞系来优化表达水平。

昆虫细胞远比许多哺乳动物细胞系更为脆弱。这些细胞在过度生长和过度分离之后，会比哺乳动物细胞出现更多损伤。在悬浮培养时一定不要让细胞密度超过8 x 10E6细胞/mL或以低于0.5 x 10E6个细胞/mL的密度下生长。昆虫细胞需要略高于哺乳动物细胞的渗透压条件（340μOsM）。昆虫细胞需要大量的O₂，特别是在蛋白表达阶段。昆虫细胞培养基比哺乳动物培养基要酸得多（pH6.0-6.4）。昆虫细胞培养基是基于磷酸缓冲体系的。因此，无需使用CO₂来维持pH值。

*注意：这类细胞贴壁较弱，当覆盖80%左右的生长表面时即会融合到一起，因此，我们推荐您在培养板中以较低百分比的融汇度来种植这些细胞。

如果细胞密度过低，而且已经培养了4-5天，我们推荐您通过100 × g离心5分钟来富集细胞，并将其重悬于新鲜的培养基中。细胞在同一培养基体系中不应滞留超过4-5天，因为这一时间段内细胞会耗尽培养基中的养分，长时间暴露于较高温度下也会导致培养基自身发生降解。当培养时出现大量细胞碎片时，也可对细胞进行离心和富集。

Sf9与Sf21细胞应是贴壁较弱的细胞。不过，某些Sf9和Sf21细胞能够非常紧密地贴附于培养容器。我们尝试使用过胰酶，胶原酶，透明质酸酶，TrypLE™ Express和的TrypLE™ Select，均未能成功传代细胞。几次传代之内细胞还可能会解离，但之后就无法有效解离了。 

最佳的方法是在T-培养瓶中培养细胞。盖紧瓶盖，并以瓶盖朝上的方向抓住培养瓶，在台面上以中等力量敲击瓶底2-3次，将会有60%-80%的细胞解离下来，但不会达到100%，这样就有足够的细胞解离下来用于传代。如果在台面敲击培养瓶过于猛烈或次数太多，细胞活力将受到很大影响。 

在可能条件下，我们推荐您以悬浮条件培养您的细胞。如果需要的话悬浮培养的细胞可随时直接传代至贴壁培养的条件。悬浮培养的细胞也能够达到更高的细胞密度，因为细胞生长不受限于表面积。

无论何时对细胞进行计数操作，您都可通过台盼蓝分析来检查细胞活力。如果细胞的活力在约95%以上，并且每25小时左右完成一次倍增，就可以继续使用。如果活力下降而倍增时间延长，可转染能力就会受到影响。传代超过30次的细胞可能会出现老化迹象，蛋白合成随之延迟。

High Five™细胞较难转染，我们通常实现的转染效率为5–13%。其他细胞类型一般能达到40-50%。同时，High Five™细胞汇聚后通常不会平滑地覆盖整个培养瓶表面，这些细胞看上去仍呈斑片状，它们开始相互交叠和接触时就开始有聚集的倾向。

我们同时推荐您以High Five™和Sf9这两类细胞来小规模尝试蛋白转染生产实验。通常每毫升的Sf9细胞培养物所生成的蛋白产物稍多，因为它们可于3–4 x 10E6个细胞/mL的密度下完成转染。High Five™在>2 x 10E6个细胞/mL的密度下就已完全进入对数生长期，因此它们不宜在高于2 x 10E6个细胞/mL的密度下进行转染。

是的，我们提供各类无血清的昆虫培养基，请点击此处浏览我们所提供的培养基以及它们之间的区别。

热灭活操作不是必需的。我们的团队直接使用未经热灭活的血清，并未发现其对细胞生长或细胞形态有任何显著影响。

许多抗生素都适用于昆虫细胞。下列为常用抗生素：

青霉素/链霉素：50–100 U/mL；50–100 µg/mL

两性霉素B(Fungizone™ 抗真菌剂）：0.25 µg/mL

庆大霉素：500 mL培养基中加入0.5 mL 10 mg/mL溶液（最终浓度10 µg/mL）

我们推荐您使用我们的Grace’s supplemented昆虫培养基（货号11667037）或SF-900™培养基（1.3X）（货号10967032）。 

Grace’s Supplemented昆虫培养基是2X的配方培养基，专为在噬斑测定实验琼脂糖覆盖层中的应用而配制。本培养基经以下成份的微调： 

• 乳清蛋白水解物
• 酵母粉
• L-谷氨酰胺
• 碳酸氢钠

点击此处获取完整配方。

SF-900™培养基（1.3X）是为Sf9和Sf21细胞准备的不含血清的低蛋白昆虫细胞培养基，适用于在噬斑测定实验1%的琼脂糖覆盖层中使用。 

24 µg/L Tween-80 

910 µg/L Pluronic Poly-all

是的，我们的Express Five™ SFM含L-谷氨酰胺，1.5 g/L。是的，本品不含蛋白，并经过无菌过滤处理。

肝素可保存于室温。肝素通常以10 µg/mL的浓度进行使用，尽管超出20倍的浓度也是可行的。

这些产品中未添加胆固醇，不过，其中含有一些可作为胆固醇前体的酵母粉和水解物。这一情况在所有无血清昆虫培养基中都很常见。

是的，我们提供不含甲硫氨酸的Grace's昆虫培养基（货号11595030）。 

补充培养基简称为TNM-FH。它包含以下成份（每500 mL）：

TC酵母粉：1.66 g，乳清蛋白水解物1.66 g，L-谷氨酰胺：0.3 g

这些添加剂能够帮助增加培养基的稳定性和延长保质期。请注意这些添加剂未经消毒，须经过滤灭菌（通过0.2 µm滤器）后方可加入。

TNM-FH未加入热灭活的10% FBS之前，不视为完全培养基。血清会提供额外的养分，同时也能够保护悬浮培养条件（即旋转器和振荡培养瓶）下的细胞免受流体压力的影响。