昆虫细胞培养支持 — 问题排查

我们一般推荐您通过机械法，而非酶促消化法（即胰酶/EDTA）解离Sf9细胞。您只需用纸巾包裹培养瓶，再将其较窄的一端在台面敲击，即可达到这一目的。这一操作会使昆虫细胞从培养瓶壁脱离下来。

这些细胞稀释过度了。一般情况下，我们推荐Sf9细胞的最低培养密度为50万个细胞/mL。

黄色颗粒可能是细胞器，聚集物或细胞碎片。我们第一次融解冻存细胞时也看到过这些粒子。为了避免出现此种现象，您可将振荡培养瓶静置5分钟，之后将上1/3的培养物转移至一个新的培养瓶中，移种之前要对细胞进行计数。您也可使用最高 200U/mL的肝素来减少聚集。终浓度为0.2%的Pluronic™溶液也可用于减少剪切力的作用，振荡速度也可增至100–120 rpm。刚刚解冻的细胞可能会发生破裂并释放出小型囊泡，这些成份在高倍放大后能够观察到。为了减少这些小颗粒的数量，应对细胞进行快速而彻底的解冻操作，这对于成功融化冻存细胞十分重要。此外：

1. 将冻存管从水浴中转移至超净台时，请将冻存管一直置于冰上。
2. 尽可能温和地进行加样操作，因为较大表面积使细胞很容易受到剪切力的损伤。
3. 从解冻后的冻存管向培养瓶中转移细胞时，不宜使用冷培养基。30-45分钟后大部分细胞一经贴壁，就应更换培养基。应使用预温的培养基（27°C）进行更换。冻存培养基中所含的10% DMSO在长时间接触后（最高1小时）会杀死细胞。

最后，需要检查细胞是否被污染。将一小部分培养物接种于T-25培养瓶中培育三天，之后检查是否浑浊。 

看起来这些细胞长得过满了。High Five™细胞在有血清存在的条件下生长极为迅速。由于这一培养瓶中没有更多空间供细胞生长，因此请尽快分种这些细胞。我们建议您按照1:15的比例进行分种，并每天观察细胞生长情况。尽管可以加入20倍浓度的肝素，我们还是推荐您使用10 μg/mL这一工作浓度。尝试加入一些FBS（0.1%）10-20分钟，之后进行换液。

这种形态的细胞一般在细胞生长数周后才会出现。对于高密度的冻存细胞或表达蛋白而言，它们并不见得有什么害处。不过，如果这些细胞的比例很高，就可能提示细胞正在发生老化，应以一管新的冻存细胞重新开始培养。