感受态细胞支持 – 问题排查

将感受态细胞保存在高于-70摄氏度的地方，即使只是保存很短的时间，也会显著降低转化效率。细胞可能仍然是活的，但将不会很好的转化。可以使用一个对照质粒，如pUC19，进行一次测试反应，以确定细胞的转化效率。这可以帮助您确定这些细胞是否还适合用来进行您的实验。

我们不建议将感受态细胞保存在液氮中，因为这会损害细胞。另外，装感受态细胞的管子可能承受不了如此低的温度，从而发生破裂。

XbaI切割位点是一个Dam甲基化敏感限制性酶切位点。TOP10是一种dam(+)菌株，它表达甲基化酶Dam。您可以试试重新转化一种dam(–)菌株，例如INV110。其它dam(–) (以及dcm(–))敏感的限制性酶切位点包括：

• Dam: Bcl I, Cla I, Hph I, Mbo I, Mbo II, Taq I, Xba I, BspH I, Nde II, Nru I
• Dcm: Ava II, EcoO 109 I, EcoR II, Sau96 I, ScrF, Stu I, Aat I, Apa I, Bal I, Kpn I, ISfi I

如果您使用的是一种mcr/mrr(+)感受态细胞株，其细胞内的酶可能会识别酵母基因组DNA上的真核细胞甲基化序列并将其删除或重排。请尝试用一种mcr/mr(–)菌株例如Top10, DH10B™, 或OmniMAX™ 2进行转化。

我们建议尝试以下措施：

• 进行pUC19转化对照；这可以告诉您所用感受态细胞的转化能力信息。
• 检查平板的过期时间以及是否使用了正确的培液（LB/琼脂）。
• 确认使用了正确的抗生素并且浓度也是对的。

无论使用何种菌株，您所要做的第一件事都是降低生长温度至30摄氏度或更低（室温）。慢速生长通常可以让E. coli更加耐受复杂序列。如果降低生长温度没有帮助，则您可能需要考虑使用其它感受态细胞比如Stbl2™或Stbl4™细胞，这类细胞已被证明在同等条件下对于上述复杂序列的耐受程度比其它菌株高。

当使用高电压在导电缓冲液中进行电转时，可能会出现电火花。MgCl2和PO4的导电能力尤其强。

以下为一些建议：

1. 将克隆反应的离子强度保持在最小。如果反应缓冲液含有高盐，在电转前请将DNA样本用水或TE缓冲液稀释。
2. 尽量避免加入导电离子。DNA溶液的体积不应超过反应总体积的5%。例如：40 μl细胞中加入2 μl DNA。
3. 确保没有气泡存在。
4. 确保电极接触是干净紧密的。擦除电转杯外面的任何沉淀物。
5. 要获得最佳结果，细胞应当被加入缝隙的最底部。轻弹电转杯使细胞沉降到底部。

以下是一些建议：

• 小片段/接头而不是您的插入片段被克隆进了您的载体。要解决这一问题，请在连接前对插入片段进行凝胶纯化。
• 确保使用了正确的X-gal和/或IPTG（当载体带有lacIq标志物时）浓度。
• 在平板上涂布X-gal和/或IPTG时，留出足够的时间让试剂充分扩散进入平板。
• 孵育平板足够长的时间以确保颜色完全显现。