PCR克隆支持 - 入门

TOPO及TOPO TA载体（非定向）加入了酚红染料。室温下溶液应该为粉红色（或者黄色）。如果在加入PCR产物后溶液变为蓝色，说明PCR缓冲液太偏碱性，转化的克隆数会变少。当溶液为黄色时，表明pH值为酸性。在pH 2.0条件下，TOPO载体仍能保持较高克隆效率。定向的TOPO及Zero Blunt TOPO载体加入了溴酚蓝。

是的，TOPO TA Cloning 和Zero Blunt cloning vectors可以用于体外转录。这些载体含有的T7、SP6 或T3启动子是活跃的噬菌体启动子，相应的聚合酶将从这些启动子转录RNA。

这些载体通常不建议用于体外翻译，因为这些载体的启动子下游（3’端）大多含有一个或多个翻译起始信号（ATG）。ATG在多克隆位点之内，这可能会干扰在插入片段中开放阅读框的翻译。

请在TOPO克隆前考虑以下问题：

• TOPO克隆不能连接带有5’磷酸基团的DNA。
• TOPO克隆效率会随着插入片段长度增加而降低，超过3 kb 建议使用TOPO XL克隆试剂盒。
• TOPO载体包含不同的抗生素抗性标记，这一点应该在购买之前考虑。
• TOPOTA载体可连接带有3’ A突出末端的片段，而Zero Blunt载体可连接带有平末端的片段。

在引物设计时请考虑以下问题：

• 3’PCR引物不能含有与5’辅助序列GTGG同源的序列。
• 使用的酶必须产生平末端的PCR产物。
• 引物不能含有5’磷酸基团，它将抑制5’ OH亲核反应基团。
• 设计引物时必须考虑读码框。

我们不建议这么做，因为这些载体的末端结合有拓扑异构酶DNA蛋白复合物。

可以，我们的pCR™2.1 TOPO TA (货号450641), pCR™4-TOPO TA (货号450030), pCRBluntII-TOPO (货号450245)均可提供单独的不含感受态的克隆试剂盒。

我们提供一项TOPO克隆载体改造服务。我们的科学家可以将您的载体改造为适用于blunt TOPO 克隆, TOPO TA 克隆, 或PCR产物定向TOPO 克隆。

对照模板的序列是受专利保护的。

两个载体的骨架非常相似。主要的不同在于pCR™II-TOPO 载体是一个双启动子载体，包含SP6和T7启动子用于体外转录/测序，而 pCR™2.1-TOPO仅包含T7启动子用于体外转录/测序。两个载体均含有M13 正向和反向引物位点用于测序或PCR检测。

两个载体的骨架非常相似。主要的不同在于pCR™4-TOPO载体测序引物位点距离PCR产物插入位点仅33 bp。这使得对插入序列进行测序时需要读取的载体序列能最小化，从而使pCR™4-TOPO载体非常适合进行测序应用。

TA克隆使用T4连接酶连接插入片段和载体，而TOPO TA克隆使用拓扑异构酶的本身性质，其能够在室温孵育5分钟内连接插入片段和载体。TOPO TA克隆重组率超过95%，而TA克隆重组率大于80%。

不，你不能用pCR™-Blunt 或pCR™-Blunt-TOPO载体克隆使用Taq DNA聚合酶扩增而来的PCR产物。 pCR™-Blunt载体被制备为平末端以接受平末端片段。因为Taq DNA聚合酶的末端转移活性，该酶产生的PCR产物带有3’-A突起。为了将这些PCR产物克隆进pCR™-Blunt，你需要将它们的末端抹平（这通常是一个低效的过程）。我们的TA Cloning试剂盒或TOPO TA Cloning试剂盒对于克隆Taq酶生成的PCR产物来说是更好的选择。 TA Cloning试剂盒包含带有3’-T突起的线性化载体用于高效连接Taq酶生成的PCR产物，无需额外操作。

如果你想使用包含Taq聚合酶和一个校对活性聚合酶的DNA聚合酶混合物，Taq酶和校对活性聚合酶的比例必须超过10:1以确保PCR产物带有3´ A突起。如果你使用的聚合酶混合物没有足够的Taq聚合酶或仅含有校对活性聚合酶，你可以在PCR反应后添加3´ A突起。请参阅产品手册获取细节。

适合TOPO TA克隆的一些Taq酶混合物的例子包括Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity和AccuPrime™ Taq DNA Polymerase High Fidelity。

不，你的基因必须用一种校对活性聚合酶例如AccuPrime™ Pfx或Platinum Pfx进行扩增以获得平末端才可用于定向TOPO克隆。

我们建议使用新鲜PCR产物用于TOPO克隆反应。Taq酶和校对活性聚合酶的比例必须超过10:1以确保PCR产物带有3´ A突起。如果聚合酶混合物没有足够的Taq聚合酶或仅含有校对活性聚合酶，可以在PCR反应后添加3´ A突起。

如果凝胶电泳显示PCR产物是干净的，没有可见的非特异性条带或引物二聚体，那么凝胶纯化是不需要的。如果PCR产物大于1.5 kb或如果凝胶电泳显示可见的非特异性条带或引物二聚体，则建议进行凝胶纯化。小片段产物比大片段产物克隆进载体的效率高很多，所以在克隆之前应该将它们去除。在PCR产物凝胶纯化后会损失一些A突起，以及一些PCR产物的损失，这些因素会导致总克隆数的轻微减少。但是，带有插入片段的克隆的比例不会发生变化，该比例通常大于90%。

在使用任何TOPO载体进行克隆时PCR引物都不能有5´磷酸基团，因为5´磷酸基团抑制TOPO克隆反应。磷酸化的产物可以进行TA克隆但不能进行TOPO克隆。这是因为所需的磷酸基团已经包含在载体的拓扑异构酶-DNA中间体复合物中。TOPO载体含有一个与拓扑异构酶共价结合的3' 磷酸基团和一个5'磷酸基团。非TOPO线性载体（TA和Blunt）含有一个3' OH基团和一个5'磷酸基团。磷酸化产物在进行TOPO-克隆之前应该用磷酸酶（CIAP）处理。使用CIAP处理可将效率提高至25%。使用5'-生物素标记的引物（或任何5'-标记，包括 5’-Cy5标记）生成的PCR产物都因为空间位阻而不能连接到任何TOPO载体中。

在进行一个TOPO克隆反应时，2 µl的PCR反应可包含最多10% DMSO或1.3 M甜菜碱而不影响TOPO反应。甲酰胺和高水平的甘油将抑制反应。这些试剂通常会被加入到PCR反应中以提高PCR产物的产量，例如，用来降低二级结构的影响或帮助扩增高GC含量的序列。我们还没有测试甘氨酸或乙酰胺对TOPO克隆反应的影响。

你可能需要尝试不同的插入片段：载体比例，从 1:1 to 15:1。

计算公式：

6X 终止溶液的成分是0.3 M NaCl，0.06 M MgCl2，而6X盐溶液的成分是1.2 M NaCl，0.06 M MgCl2。终止溶液仅包含在 TOPO XL 克隆试剂盒，而盐溶液目前包含在所有其它TOPO试剂盒中。这些溶液可以阻止拓扑异构酶重新结合并使质粒产生切口，后者将降低TOPO反应的克隆数量。

将TOPO载体和插入片段反应混合物在4°C保存一星期被证明不会影响 TOPO反应的克隆效率，因为仍有超过95%的克隆含有插入片段。但是，总克隆数降低了10倍。将TOPO反应混合物放于4°C过夜后总克隆数和新鲜TOPO反应混合物比较没有或仅有轻微降低。

常规 TOPO TA克隆试剂盒对于小于4 kb左右的PCR产物能进行高效克隆。如需克隆更大插入片段（3-10 kb），我们建议使用TOPO XL试剂盒。对于将较大插入片段克隆进TOPO TA载体，以下是一些建议：

1. pCR-XL TOPO克隆试剂盒使用结晶紫染料替代溴乙锭（EtRr）在凝胶分离时对PCR产物染色。这降低了使用EtBr染色时在凝胶分离后经常出现的DNA切口现象。带有切口的DNA是不好的克隆底物，并且会更迅速的被核酸酶降解。如果没有结晶紫，那么请在凝胶中使用较低浓度的EtBr，仅使其足够显示目的片段用于纯化即可。100 mL琼脂糖凝胶使用0.5 µL 10 mg/mL EtBr存储液即可。
2. 将TOPO反应的孵育时间增加到30分钟到1小时。只要TOPO反应中使用的是盐溶液，则更长的孵育时间不会产生不良影响。更长孵育时间可以提高长PCR片段的克隆效率；延长孵育时间对短片段而言几乎没有什么好处。
3. 使用较低的插入片段：载体比，最好为1:1（范围可以在0.5:1 或 2:1）。如果插入片段的浓度过高，则PCR产物的一端和载体的一端结合，而PCR产物的另一端可能会和溶液中的其它游离PCR产物竞争载体的另一端。这种竞争当插入片段大小增加时会变得更显著，并可能降低转化后产生的克隆数。
4. 将反应稀释至20 µl，同时保持相同数量的载体和插入片段。将盐溶液体积增加到3.7 µl以补偿增加的体积。稀释反应可以进一步降低对于载体末端的竞争。上述任何一种策略或多种策略的结合都会提高TOPO反应的大插入片段的克隆效率。需要记住的是TOPO反应有很强的片段大小偏好，而PCR反应体系中的任何小片段都会比目的片段更高效的克隆，即使该小片段在凝胶电泳时不可见。因此我们强烈建议将PCR产物进行凝胶纯化。在TOPO克隆反应体系内加入盐溶液可以将转化后的克隆数增加2到3倍。在盐溶液存在时，高于5分钟的孵育时间也会增加转化后克隆的数量，这一点也已被证明。盐溶液可阻止拓扑异构酶I在PCR产物连接并从DNA上解离后与其重新结合并可能使DNA产生切口。

Any single or combination of the above strategies should improve the efficiency of cloning larger inserts in a TOPO reaction. Keep in mind that the TOPO reaction does have a strong size bias, and that any smaller fragments present in the PCR reaction would clone much more efficiently than the fragment of interest, even if the smaller fragment is not readily visible on a gel. Therefore, it is highly recommended that the PCR product of interest be gel-purified. The inclusion of salt solution in the TOPO cloning reaction increases the number of transformants 2- to 3-fold. It has been also observed that in the presence of salt, incubation times of greater than 5 minutes will also increase the number of transformants. Salt prevents topoisomerase I from rebinding and potentially nicking the DNA after ligating the PCR product and dissociating from the DNA.

如果使用常规TOPO试剂盒，这里是一些提高效率的建议：

1. 使用结晶紫替代溴乙锭（EtBr）在凝胶分离过程中对PCR产物染色以避免DNA切口的出现。
2. 提高TOPO反应孵育时间至30分钟。
3. 保持较低的插入片段：载体摩尔比，最佳比值为1:1。
4. 将反应稀释至20 µl，同时保持相同数量的载体和插入片段。将盐溶液体积增加到3.7 µl以补偿增加的体积。稀释反应可以降低对于载体末端的竞争。

该实验方案包含一个新的15分钟凝胶纯化步骤，以提高对于长PCR产物的克隆效率。凝胶纯化去除了易于和载体连接的小片段PCR产物。另外，TOPO XL PCR克隆试剂盒实验方案避免了使用会造成长的PCR产物造成切口并降低克隆效率的溴乙锭和紫外光。试剂盒使用结晶紫对DNA染色并在环境光线下观察。在平行实验中，使用结晶紫对长片段PCR产物染色并纯化获得了94%的重组克隆而使用溴乙锭染色和紫外光观察仅获得60%的重组克隆。

dATP是一个竞争性抑制剂。磷酸基团将降低连接效率。连接缓冲液中的去垢剂可能不会影响酶活性。高浓度(0.2 M)的Na2+, K+, Cs+, Li+, 和NH4+几乎可以完全抑制酶活性。多胺、精胺和亚精胺也是抑制剂。

因为您的PCR产物较小，我们建议您使用pCR™2.1 TOPO载体。这一大小的片段将不能完全破坏pCR4™-TOPO载体内的ccdB基因，因此你可能不能得到克隆，因为ccdB对E. Coli是致死的。

是的，但是您需要使用牛小肠磷酸酶(CIP)对其进行处理以除去5’磷酸基团才能用于TOPO克隆。

我们建议您使用我们的TOPO TA cloning kit for sequencing，它包含pCR™4 TOPO载体，或者使用我们的Zero Blunt TOPO PCR cloning kit for sequencing,，它包含pCR™4Blunt-TOPO载体。

我们建议使用我们的pENTR D-TOPO试剂盒能兼容Gateway系统，轻松实现TOPO克隆的同时具有定向性优势。

最少需要150 bp的插入才能确保破坏ccdB基因并避免细胞死亡。（参考文献：Bernard et al.,1994. Positive-selection vectors using the F plasmid ccdB killer gene. Gene 148: 71-74.）

TOPO载体包含LacZ-ccdB基因元件（LacZ-ccdB cassette），通过破坏E. Coli致死基因ccdB实现对重组克隆的直接筛选。PCR产物的连接破坏了LacZ-ccdB融合基因的表达从而允许转化后的阳性重组克隆生长。含有非重组载体的细胞在涂板后被杀死。因此不需要使用蓝白斑筛选。