核酸标记支持 - 入门

请参见下表所示的各种核酸标记方法的比较：

该试剂盒最适于标记18至24个碱基的5’-氨基修饰的寡核苷酸，每次反应50 μg。稍微长一些或短一些的寡核苷酸可以用相同的实验步骤进行标记，但是对于很长或很短的寡核苷酸，您可能需要调整实验步骤。我们没有测试过用该试剂盒标记含有多个氨基的寡核苷酸。

该试剂盒包含我们的Alexa Fluor氨反应性琥珀酰亚胺基或四氟(TFP)酯染料，它可以和伯胺共价偶联。

每管中精确的氨基反应性染料的量是保密的；但是，每管提供的染料量最适于标记50ug 长度在18至24碱基的5’-氨基修饰的寡核苷酸。试剂盒包含3管染料，总共可用于3次反应。氨基反应性Alexa Fluor染料也可以作为单独试剂购买，试剂规格从100 µg至25 mg不等。

我们建议使用凝胶电泳或在乙醇沉淀后使用逆相HPLC。更多关于纯化步骤的细节请参阅产品手册：

Alexa Fluor 寡核苷酸胺基标记试剂盒产品手册

• 氨基修饰的寡核苷酸可以从提供定制寡核苷酸服务的商家获得。想了解更多关于我们的DNA寡核苷酸定制服务的信息，请点击这里。

ChromaTide染料标记的dUTP和UTP核苷酸可以被用来合成带有标记的核酸探针而无需接触危险而且昂贵的同位素标记的核苷酸。您可以使用标准分子生物学技术将这些带标记的核苷酸掺入探针，然后用带标记的探针进行原位杂交、基因芯片或印迹分析。ChromaTide染料标记的核苷酸有多种荧光颜色可供选择，便于进行多色分析。

ChromaTide dUTP和 UTP核苷酸是通过一个独特的烷基侧链接头对尿嘧啶C-5位进行修饰的。这个接头可以增加核苷酸和染料之间的间隔从而减少他们之间的相互作用。这些核苷酸中的一些还包含一个额外的spacer，从而进一步将核酸和标记基团隔开。产品名称中的数字，例如fluorescein-12-dUTP中的“12”，指的是spacer的净原子数长度。

能够将ChromaTide dUTP高效掺入DNA的方法有切口平移，随机引物标记，通过末端转移酶（Tdt）进行的末端标记，以及逆转录。ChromaTide UTP可通过体外转录掺入到RNA中。你可以在下面找到使用这些酶促反应的实验步骤。某些荧光标记的ChromaTide核苷酸可能不适用于某个特定的酶促方法，所以我们建议您在购买前参阅ChromaTide产品手册中的表1。一些ChromaTide产品已经停产，所以并不是所有列出的ChromaTide核苷酸目前都是可订购的：

ChromaTide标记核苷酸产品手册
酶促方法掺入ChromaTide dUTP
酶促方法掺入ChromaTide UTP

虽然我们有一个使用PCR进行掺入的实验方案，但是我们不建议使用PCR作为任何荧光或修饰核苷酸的最佳掺入方法。使用PCR时，掺入率非常低。我们曾经使用Taq聚合酶成功过；但是很多现在的DNA聚合酶保真度更高而且合成错误更少；因此，它们掺入修饰核苷酸的效果不是很好。下列文章对不同商品化的聚合酶对不同染料或修饰的核苷酸在PCR反应中掺入效率进行了比较：

Anderson JP, Angerer B, Loeb LA (2005) Incorporation of reporter-labeled nucleotides by DNA polymerases. Biotechniques 38:257–264.

平均掺入率是大约每100-150碱基掺入一个染料分子，所以ChromaTide荧光标记核苷酸通常是我们提供的核酸标记方法里标记率最低的。

碱基-染料比例可以通过测定核酸在260 nm的吸光值和染料在其最大吸收峰的吸光值而确定。使用相应染料和核酸的消光系数，您就可以通过Beer-Lambert定律计算出被标记核酸的碱基-染料比例。详细的说明可以在下列产品说明中找到：

酶促方法掺入ChromaTide dUTP
酶促方法掺入ChromaTide UTP

不能，它们不是细胞通透的所以它们仅适用于体外掺入方法。荧光染料和磷酸基团电荷太高因而不能穿透完整细胞膜。不带磷酸基团的非荧光染料例如EdU, EU, 或BrdU可以用于活细胞核酸掺入研究。

ARES™ Alexa Fluor DNA标记试剂盒提供了一种灵活的两步法对DNA进行Alexa Fluor染料标记。在第一步中，一个氨基修饰的核苷酸通过酶促标记方法被掺入到DNA中。在第二步中，氨基修饰的DNA被具有氨基反应活性的Alexa Fluor染料通过化学标记方法进行标记。标记后的探针可以用于：

• 荧光原位杂交（FISH）。参阅Buster DW, Daniel SG, Nguyen HQ, et al. (2013) SCFSlimb ubiquitin ligase suppresses condensin II–mediated nuclear reorganization by degrading Cap-H2, J Cell Biol 201(1):49–63.
• 基因芯片技术。参阅 Shin HH, Hwang BH, Seo JH et al. (2014) Specific discrimination of three pathogenic Salmonella enterica subsp. enterica serotypes by carB-based oligonucleotide microarray. Appl Environ Microbiol 80(1):366–373.

请参阅下列图片以了解ARES™ Alexa Fluor DNA标记试剂盒是如何工作的。

Alexa Fluor染料标记的cDNA用于基因芯片或FISH（荧光原位杂交）应用时，其染料-碱基比在1:12到1:35之间是合适的范围。

在染料碱基比相同时，Alexa Fluor染料在高标记比时表现出更高的荧光强度和较低的自淬灭效应。下列图片比较了Alexa Fluor 555 和Cy3，以及Alexa Fluor 647和Cy5染料的染料碱基比和荧光强度。

下列图片比较了相应染料的荧光发射峰值和波长。

ARES™标记的探针可以在任意缓冲液、TE、福尔马林、杂交缓冲液或乙醇中长期保存。我们建议使用您的常规存储条件保存探针，只需保持避光。ARES™偶联物是非常稳定的。

ARES™标记的寡核苷酸在95°C时5分钟应该没太大影响。

很不幸的是，Alexa Fluor 633由于其化学结构而不能标记核酸。更重要的是，Alexa Fluor 633标记的DNA探针在核酸杂交实验中不能形成稳定的杂交。

不同批次制备的RNA肯定会得到不同的结果。大多数时候，mRNA是被显著降解的。酶促法掺入氨基酰dUTP（AA-dUTP）的效率在不同实验之间应该是相同的。如果有不同，则引起不同的原因应该是RNA或是方法本身。AA-dUTP的掺入和染料-核苷酸的偶联没什么不同，并且应该更高效和均一。

这里有几个建议：

1) cDNA可能在标记之前丢失了。在使用乙醇沉淀cDNA之前，可以向其中加入1 µL，内含10–20 µg的糖原（分子生物学级别）。

2) 确保加入的盐是醋酸钠而非醋酸铵。在cDNA沉淀之后，将其重悬在5 µL水中。

3) 如果生成的是长链cDNA，那么将样本加热变性将会有帮助。将样本在95°C 加热5分钟然后在冰上放置数分钟。然后在标记前将其离心数分钟。

4) 在进行标记反应时试管应当处于室温。向试管内加入3 µL缓冲液。然后加入染料并剧烈震荡混匀至少15秒。

ULYSIS寡核苷酸化学标记试剂可以实现快速简便的将荧光染料加到核酸聚合物的嘌呤碱基上。这一方法又叫做通用连接系统 (Universal Linkage System，ULS™)，是基于铂金修饰的染料在鸟嘌呤N7位形成一个稳定的加合物。ULYSIS标记探针可以用于荧光原位杂交（FISH）和许多其它应用。

我们建议先使用乙醇沉淀将样本浓缩并计算DNA浓度和标记度。

在标记和纯化DNA之后，您可以向其中加入10 µg鲑精DNA。这将提高您沉淀后的回收率。

使用ULYSIS核酸标记试剂盒标记的寡核苷酸在100°C可以稳定存在5分钟，并且在68°C保存过夜不会引起复合物的解离。

用ULYSIS核酸标记试剂盒标记更大的探针是可能的，但是可能需要将染料稀释以避免（或至少减少）聚合现象的发生。请参考这篇文献： Coelho-Castelo AA, Santos Júnior RR, Bonato VL et al. (2003) B-lymphocytes in bone marrow or lymph nodes can take up plasmid DNA after intramuscular delivery. Hum Gene Ther 14(13):1279–1285.

这里是一个从DNA标记实验方案修改而来的初步实验方案：不要使用核酸酶处理RNA，而是直接在90°C孵育10分钟或在85°C孵育1分钟进行标记。每1μg RNA加入2 μg糖原，然后通过乙醇沉淀进行纯化。请参考以下文献：

• Babak T, Zhang W, Marros Q et al. (2004) Probing microRNAs with microarrays: tissue specificity and functional inference. RNA 10(11):1813–1819.
• Hiley SL, Jackman J, Babak T et al. (2005) Detection and discovery of RNA modifications using microarrays. Nucleic Acids Res 33(1):e2.
• Torchet C, Badis G, Devaux F et al. (2005) The complete set of H/ACA snoRNAs that guide rRNA pseudouridylations in Saccharomyces cerevisiae. RNA 11(6):928–938.

是的，已经有许多使用ULYSIS标记探针进行基因芯片分析的例子。这里是一些供您参考的文献：

• Babak T, Zhang W, Marros Q et al. (2004) Probing microRNAs with microarrays: tissue specificity and functional inference. RNA 10(11):1813–1819.
• Hiley SL, Jackman J, Babak T et al. (2005) Detection and discovery of RNA modifications using microarrays. Nucleic Acids Res 33(1):e2.
• Torchet C, Badis G, Devaux F et al. (2005) The complete set of H/ACA snoRNAs that guide rRNA pseudouridylations in Saccharomyces cerevisiae. RNA 11(6):928–938.

这些探针不会像放射性探针一样发生放射性衰变；所以你至少可以将它们保存一年。

它可以被用来标记单链反义RNA以用于Northern印迹，Southern印迹或原位杂交。该试剂盒还可以用于标记PCR产物，质粒，凝胶纯化的cDNA片段，以及用于Northern印迹、Southern印迹或原位杂交的寡核苷酸。当使用Ambion BrightStar BioDetect™试剂盒进行非同位素检测和BrightStar-Plus正电性尼龙膜时，其灵敏度和³²P放射性标记的探针以及酶促标记的生物素探针相当。

1. Sample purity:

• 样本中不能有游离核苷酸（例如，来自于PCR反应的游离核苷酸）
• RNA samples must be free of DNA, e.g. a transcription template.
• 样本必须不含蛋白。
• 核酸溶液应该不含酚或乙醇污染，pH值应当在2.5到10之间，而盐浓度应当少于20 mM。

2. 样本浓度应该在0.5–50 ng/μL之间。

可以使用下列公式计算放射性标记探针的当前反应活性（current specific activity）：cpm/µL =初始cpm/µL/2^（初始读数后天数/14.3）