核酸标记支持 – 问题排查

以下是一些可能的原因及我们的建议：

• 检查Alexa Fluor氨基反应染料的生产日期及其储存条件。染料对水敏感，如果暴露在潮湿的环境或者水中，将可能会失去活性。它们应该以粉末形式保存，并保持干燥防水。应该使用无水DMSO溶解染料，并且一旦将染料溶于DMSO，需要立刻使用，因为溶解后染料会对水分更加敏感也会更加不稳定。活性染料同样也需要避光保存。以粉末形式保存于干燥避光条件下时，染料至少可以在六个月内保持稳定；超过此保存时间的染料可能会水解并不再具有反应活性。
• 有一些反应需要较高的染料：寡核苷酸摩尔比，因此在反应中你可能需要使用更多的染料或者更少的寡核苷酸。
• 标记反应在微碱性的pH下效果最好，此时寡核苷酸的氨基去质子化，因此在反应中应该使用0.1M硼酸钠，pH 8.5的标记缓冲液。为获得最佳效果，不应使用其它缓冲液，因为pH值可能不合适，或者有可能含有干扰反应的组分。
• 确保反应中没有蛋白质或伯胺。反应前，应将氨基修饰的寡核苷酸进行提取及纯化以去除各种胺，如Tris，三乙胺，铵盐，甘氨酸，牛血清白蛋白，或其它含胺的分子，因为它们会与氨基反应性染料相互作用而降低其反应效率。
• 检查检测所用的荧光滤光片，确保其与染料相兼容。你也可以在所用滤光片下检测一小滴没有稀释的染料，确保在与寡核苷酸结合前你能对单独的染料本身成像。Alexa Fluor 647的发射荧光是肉眼不可见的，因此需要远红外成像系统进行检测。

没有充分去除游离染料可能造成高背景。尝试使用HPLC或凝胶电泳纯化寡核苷酸确保去除没有反应的染料。

• 检查碱基和染料的比例，确定ChromaTide核苷酸掺入水平。由于荧光检测可能受标记不足、过度标记、仪器灵敏度或其它因素影响，所以碱基与染料的比例是更好的检测掺入效率的指标。
• ChromaTide核苷酸在酶促标记反应时可能没有很好的掺入。确保所使用的酶促方法与特定的荧光ChromaTide核苷酸兼容，因为一些方法可能并不是对所有应用都适合。您可能还需要进一步优化酶促掺入方法，如优化酶浓度、孵育时间、浓度及标记核苷酸与未标记核苷酸的比例。对于PCR，保真度低一些的聚合酶可以得到更高的掺入率；当然，使用PCR时，掺入率通常都较低。
• 检查检测所用荧光滤光片，确保其与染料相兼容。你也可以在所用滤光片下检测一小滴没有稀释的染料，确保在没有与寡核苷酸结合前你能对染料单独成像。Alexa Fluor 647的发射荧光肉眼不可见，因此需要远红外成像系统进行检测。

你可以尝试使用合适的基于离心柱的方法纯化ChromaTide标记的探针以去除未掺入的ChromaTide核苷酸。乙醇沉淀可能不能有效的去除未掺入的ChromaTide核苷酸，因此需要使用离心柱进行纯化。

使用BrightStarPsoralen-Biotin非同位素标记试剂盒对核酸标记后将不能在260 nm波长下对核酸进行定量，因为补骨脂素在此波长上也有吸收峰，会干扰准确读数并可能破坏生物素与核酸的交联。建议在使用BrightStarPsoralen-Biotin非同位素标记试剂盒前对核酸进行定量。该方法标记后的产率将达到90–100%，在正丁醇萃取步骤会有轻微的损失。

如果试剂盒提供的阳性对照在100 fg 至1 pg范围内可被检测到，说明BrightStar Psoralen-Biotin 非同位素标记试剂盒以及生物素检测系统是正常工作的，但是测试核酸标记效率低，我们建议将起始材料进行凝胶电泳以确定它的完整性。如果通过凝胶电泳证明测试核酸是完好的，那么可能存在干扰标记反应的抑制剂。来自于体外转录反应或PCR反应的游离核苷酸的存在可能会造成这一问题。可以通过盐/乙醇或异丙醇沉淀，然后用70%乙醇洗涤以除去游离核苷酸。使用BrightStar Psoralen-Biotin 非同位素标记试剂盒时有很多因素会影响对核酸的高效标记。标记实验一定要严格按照要求进行操作。下面列出了一些关键的变量：

1. 确保使用正确波长的紫外灯。只有长波紫外灯（365 nm）是有效的。不应该使用短波紫外灯（254 nm）或中波紫外灯（310 nm）；短波辐射尤其会损伤核酸。
2. 反应必须在暗处进行。如果有必要，可以在反应体系配制好之后将灯完全关闭。
3. 适当的热变性对于高效标记DNA是很关键的（参见产品手册第7页的步骤2-3）。确保在100°C下至少热变性10分钟，然后立刻将样本在干冰/乙醇浴中迅速降温（也可以使用液氮或冰水浴）。
4. 核酸溶液的pH值必须在2.5到10之间。
5. 盐浓度必须小于20 mM。
6. 我们发现经常只需15分钟的辐射就足以得到高特异性的探针。我们不建议辐射样本超过1小时。

下面一些建议可能有助于降低使用BrightStar Psoralen-Biotin 非同位素标记试剂盒进行印迹杂交实验时的背景：

1. 在使用前过滤探针和杂交溶液。
2. 所用探针浓度不要超过产品手册第9页《使用BrightStar Psoralen-Biotin 标记探针第三部分D》中推荐的用量。
3. 提高杂交和洗涤缓冲液中的SDS浓度（最多可到2%）。
4. 在与抗体：偶联物溶液孵育前和孵育后提高封闭时间。
5. 使用较低浓度的抗体：偶联物溶液。
6. 在结合和封闭步骤之后延长洗涤时间和/或增加洗涤次数。

核酸底物中可能有抑制剂。如有必要，可以使用酚：氯仿：异戊醇提取加离心柱纯化的方法纯化您想要标记的核酸。另外，RNA的5’末端有可能因为三级结构不容易被接触到。在这种情况下，可以尝试在反应前将RNA在90°C加热5分钟，然后立刻将其置于冰上。

我们建议使用酚/氯仿提取加乙醇沉淀的方法纯化激酶反应产物，然后洗脱DNA。如果这样仍然不行，可以使用离心柱层析或变性聚丙烯酰胺凝胶电泳进一步纯化反应产物。