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RNA起始量较少可导致cDNA得率低。对于标准文库构建请使用0.5–5 µg起始mRNA,检验mRNA完整性,并使用RNA对照进行反应。尝试使用放射性标记实验方案评估cDNA合成反应的效率。我们也建议对转化效率和Gateway酶效率进行检测。
如果没有正确准备用于不同大小片段分离的柱子,也会导致cDNA得率低。在加入更多缓冲液前,应使柱子完全干燥,并应确保流速/液滴大小合适。
较小的平均插入片段大小可能是因为attB1接头污染、mRNA样品部分降解、片段分离存在问题和/或起始mRNA量不足。
检查一下BP重组中使用的cDNA量是否不足,因为这可能使得重组子比例较低。
当克隆含有较小的插入片段时,更有可能在相似的attL1和attL2位点之间形成一个发夹结构,从而容易发生上述情况。为了解决这一问题,请遵循以下建议:
For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures.