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重组Taq聚合酶和天然Taq聚合酶的活性、特异性、热稳定性和PCR性能基本相同。但重组Taq聚合酶在细菌系统上表达和纯化,而天然Taq聚合酶直接从宿主体内纯化得到。
我们提供的Pfx50™ DNA聚合酶表现出了超出Taq DNA聚合酶50倍的保真度。
请见下面的比较表:
酶 | 相对保真度 | 扩增长度 | 3'端A 尾 |
---|---|---|---|
Taq | 1 | <5 kb | + |
Platinum Taq | 1 | <10 kb | + |
AccuPrime™ Taq | 2 | <5 kb | + |
Platinum Pfx | 26 | <12 kb | - |
AccuPrime™ Pfx | 26 | <12 kb | - |
Pfx50™ | 50 | <4 kb | - |
Platinum Taq HiFi | 6 | <20 kb | +/- |
AccuPrime™ Taq HiFi | 9 | <20 kb | +/- |
AmpliTaq | 1 | <5 kb | + |
AmpliTaq Gold | 1 | <5 kb | + |
AmpliTaq Gold 360 | 1 | <5 kb | + |
Taq酶错配率:1 x 10-4至2 x 10-5碱基/每次复制
是的,可以用具有校读功能的聚合酶进行PCR反应。但在进行TA克隆之前,您需要在PCR产物3'端添加A尾。
我们会建议您使用我们的AccuPrime™GC-Rich DNA聚合酶,它是针对高GC含量模板(GC 含量>65% )而开发的。此外,您可以用PCRx Enhancer系统配合DNA聚合酶(其中包括天然/重组Taq、Platinum Taq、以及 Platinum Taq 高保真聚合酶)一起使用,以扩增高GC含量和较难扩增的模板。最后,经研究证明,含有360 GC Enhancer缓冲液的AmpliTaq Gold 360可以用于GC含量高达80%的模板。
我们强烈建议您使用MgSO4。尽管MgCl2在某些情况下也有效,但MgSO4通常可以获得更加稳健、可重复的产物——因为硫酸根是最适于Platinum Taq高保真聚合酶的阴离子。
使用Platinum 技术时,在94°C的变性步骤之前,抗DNA聚合酶的抗体结合在酶上。在变性步骤中,抗体将随之降解,聚合酶活化,引物开始介导延伸。AccuPrime™ Taq将PlatinumTaq (Taq + Platinum抗体) 与我们专利的热稳定 AccuPrime™ 辅助蛋白相结合。10x反应缓冲液中包含了该辅助蛋白,以提高每轮PCR反应中引物和模板结合的特异性。
The 10X PCR buffer for Platinum Taq is not available as a stand-alone item. It is only supplied as part of the enzyme kit.
Yes, the Platinum Multiplex PCR master mix contains Platinum Taq DNA Polymerase that leaves A overhangs on PCR products.
AmpliTaq Gold和Platinum Taq都是热启动酶,均支持在无冰的情况下在实验台上配制反应体系。AmpliTaq Gold是一种化学修饰的热启动酶,以非活性状态提供。在95°C下,该酶可在10分钟后完全热激活。Platinum Taq是一种抗体介导的热启动酶。抗Taq抗体会与酶结合并抑制酶的活性,直至PCR反应的热变性阶段(30秒到2分钟),该酶的活性才被激活。
是的,该酶混合物会使一部分PCR产物留下3′端 A尾。然而相对于单独采用Taq聚合酶,克隆效率会大幅度下降。建议在PCR产物添加3′端 A尾后再进行TA克隆。
就我们的经验来看,Gold Buffer有最好的性能。这三种缓冲液各自的配方如下:
GeneAmp 10X PCR Buffer:100 mM Tris-HCl,500 mM KCl,15 mM MgCl2,pH 8.3, 0.01% (w/v) gelatin
GeneAmp 10X PCR Buffer II*:100 mM Tris-HCl,500 mM KCl,pH 8.3
GeneAmp 10X PCR Buffer Gold*: 150 mM Tris-HCl, 500 mM KCl, pH 8.0
*缓冲液配有单独的 MgCl2 溶液 (25 mM).
PCR的主要步骤是:变性、退火、延伸。通常情况下,需要将模板加热到较高温度(大约94-95°C)使双链DNA变性成为单链。然后,将温度降到50-65°C,使引物退火到模板上互补的碱基配对区域。之后,再将温度升高到72°C,使聚合酶结合到模板并合成一条新DNA链。
热启动是一种可防止DNA在不恰当的时机出现扩增的方法。为此,您可在冰上建立PCR反应,从而防止DNA聚合酶一开始便处于活性状态。更简单的做法则是使用一种“热启动”酶——这种酶在供应时为非活性状态,高温加热步骤之后才会活化。
MgCl2浓度应针对每种模板和引物对进行优化。一般而言,终浓度介于0.5-2.5mM之间(使用0.2mM 的dNTP时)。注意:EDTA或过量dNTP会螯合Taq DNA聚合酶活化所必需的镁离子,进而抑制扩增。
尽管实际体积取决于用于第一链合成反应的RNA起始量和靶标基因的丰度,但我们建议使用10%的第一链cDNA反应产物进行PCR反应。
降落PCR指的是每经过一个循环,退火温度都下降1°C,直至设定的“降落”退火温度,并且余下的循环都使用这个降落退火温度。降落PCR会增加特异性并减少背景扩增。以高退火温度开始PCR反应时,只会扩增您感兴趣的基因,从而使您可以积聚靶标产物。在接下来的PCR循环中降低退火温度,则可使特异性模板得到有效扩增。
巢式PCR需要两次独立的扩增 - 第一次用一组PCR引物,而第二次使用内部的“巢式”引物 及 1%或更少的第一次PCR反应产物作为模板。如果靶标丰度太低,或者同时产生非特异性PCR产物与特异性产物,可以使用巢式PCR。而当序列信息很有限,仅能设计第一次PCR产物一端的内侧引物时,可以使用半巢式PCR,例如RACE(cDNA末端快速扩增反应)。
通常情况下,引物的退火温度应该比引物熔解的最低温度要低3-5°C。如果温度过高,引物的退火效果就不佳;如果温度过低,会出现非特异性退火。
高GC含量的模板通常具有较高的熔解温度,在正常的反应条件下可能不能完全变性。
您可以尝试加入5%-10%的DMSO、至多10%的甘油或者1-2%的甲酰胺,或者联用这些方法促进这些难扩增模板的扩增。注意:使用助溶剂会降低您的引物的最佳退火温度。
退火温度相对较高时,您可以选择使用双温度实验方案。此时,退火和延伸步骤放在一起进行,例如,两者都可在>62°C的温度下发生。相对常规的三温度实验方案(三步法),双温度实验方案的优势是速度快得多。
以下指导原则可能有助于您设计自己的PCR引物:
如需了解更多关于引物设计的提示和工具,请点击此处。
有的。OligoPerfect™ Designer即可为测序、克隆或检测等应用设计引物。
将装寡核苷酸的离心管离心几秒钟,使寡核苷酸聚集到离心管的底部。小心打开离心管,以适当体积的TE(10 mM Tris-HCl,pH 8.0,1 mM EDTA)溶解寡核苷酸。推荐使用TE而不是蒸馏水溶解,因为水的pH通常是弱酸性的,会导致寡核苷酸水解。最好用移液器上下吹打该溶液至少10次。如需了解引物浓度和重悬体积计算方法,请点击访问此网页。
Life Technologies™公司的寡核苷酸是冻干形式提供的。冻干(以及重悬)的寡核苷酸建议在-20°C下储存。冻干的寡核苷酸在-20°C下至少可以稳定保存1年。溶解在TE中的寡核苷酸在-20°C 或4°C下至少可以稳定储存6个月。在没有核酸酶的情况下,溶解在水中的寡核苷酸在-20°C下可以稳定储存6个月。冻干的寡核苷酸在室温下可至少稳定放置几个月。在-20°C下储存的浓度大于10 μM的寡核苷酸溶液,可以稳定放置至少6个月。如果寡核苷酸储存在4°C下,则务必将它们重悬在TE缓冲液而不是水中。(注意:在4°C条件下的水中,寡核苷酸会随着时间推移而水解)。AP和HRP偶联物放置在它们各自的储液中发货。请将它们储存在4°C条件下。
根据您的具体应用,可能需要不同的纯化水平。请参考此表格。
寡核苷酸采用DNA合成仪制备,后者大致相当于一个计算机控制的试剂递送系统。第一个碱基附到固相支持物上——此类固相支持物通常是玻璃或者聚苯乙烯珠子——用于将延伸的DNA链固定到反应柱上。DNA合成包括一系列的化学反应。
合成的规模是合成的起始用量,而不是担保的终产量。我们以最小OD单位保证寡核苷酸的总得率。您可 点击此链接查看我们提供寡核苷酸时所担保的最低得率。
偶联效率是影响合成DNA长度的主要因素。碱基组成和合成规模也有影响作用。在99%的偶联效率下,合成95-mer的粗溶液中将包含38%的全长产物和62%(nx)的失败序列。这一数字尚未将脱嘌呤作用等其他化学效应考虑在内。脱嘌呤作用主要影响A碱基。脱嘌呤的频率很低,但会随着引物长度的增加而显著增加。鉴于此,我们规定核苷酸的最大长度是100个碱基,我们也认为这是可确保能够进行常规、经济地合成的最大长度。
偶联效率是评价DNA合成仪将新碱基添加到逐渐延伸的DNA链上的效率的指标。如果DNA链上每个可用碱基都与新碱基成功反应,则偶联效率为100%。不过很少有化学反应能够实现100%的效率。在DNA合成过程中,可实现的最高偶联效率通常在98%到99%之间(通常是99%)。这意味着在单个偶联步骤中,DNA链上1%至2%的可用碱基未能与新加的碱基发生反应。全长寡核苷酸占合成产物的百分比可通过偶联效率的n次方(n为引物长度,即循环数)来进行估算,如长度为22的寡核苷酸,可获得0.9922 x 100% = 80%的全长引物。您可以将引物进一步纯化,从而获得含量为95%的全长寡核苷酸产物。对于较长的寡核苷酸,强烈建议您进行纯化操作。举例来说,一个64-mer的引物,在合成过程中将只能获得0.9964 x 100% = 53%的全长寡核苷酸。而且这还需要每一偶联循环的效率都达到99%才能实现。
三苯甲基基团与DNA碱基相连时是无色的,一旦从碱基上去除则呈现橙色。该颜色的强度可通过紫外分光光度计测得,且与存在的三苯甲基分子数量直接相关。通过比较整个合成过程中释放的三苯甲基的吸光值,可以计算出成功偶联的碱基比例,进而获得偶联效率。
在DNA合成过程中,偶联效率是一个重要因素,这是因为其影响具有累积效应。下表显示了1%的偶联效率差异所引发的效应,以及在不同长度寡核苷酸合成过程中,该种差异对全长产物的得率造成的影响。即使是合成相对较短的20个碱基的寡核苷酸,哪怕偶联效率存在1%的差异,也会造成全长产物得率相差15%以上。
添加的碱基数量 | 99%偶联效率下的全长产物的百分比 | 未能合成全长产物的百分比 | 98%偶联效率下的全长产物的百分比 | 未能合成全长产物的百分比 |
---|---|---|---|---|
1 | 99 | 1 | 98 | 2 |
2 | 98.01 | 1.99 | 96.04 | 2.96 |
3 | 97.03 | 2.97 | 94.12 | 5.88 |
10 | 90.44 | 9.56 | 81.71 | 18.29 |
20 | 81.79 | 18.21 | 66.76 | 33.24 |
30 | 73.79 | 26.03 | 54.55 | 63.58 |
50 | 60.5 | 39.5 | 36.42 | 63.58 |
95 | 38.49 | 61.51 | 14.67 | 85.33 |
全长寡核苷酸的百分比取决于化学合成的偶联效率。此类化学合成的平均偶联效率接近99%。计算全长寡核苷酸的百分比时,可采用以下公式:0.99n-1。因此,离心管里79%的寡核苷酸分子长度是25碱基,其余的寡核苷酸长度则<25个碱基。如果您关心如何着手制备全长核苷酸,可以考虑采用柱体纯化、PAGE或HPLC纯化。
请查看此列表了解我们所提供的标准修饰选择。如果您未能找到自己想要的修饰选项,请发送邮件到CNlifescience-CNTS@thermofisher.com 联系我们的技术支持团队,询问我们是否能够满足您的要求。
Unless you specifically request that primers be supplied in solution, they are shipped lyophilized. We recommend reconstituting them in the appropriate volume of TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0).
We offer TE Buffer, pH 8.0 (Cat. Nos. AM9849 and AM9858), that consists of 10 mM Tris (adjusted to pH 8.0 with HCl) and 1 mM EDTA.
Yes, we can synthesize primers with degenerate bases. Click here for the electronic ordering code to use.
No, the primer will not have this modification. You must specify that it should have a 5’ phosphate modification.
计算引物Tm的常用公式如下:
Tm (°C) = 2 (A+ T) + 4 (G + C)
引物的一个重要参数是熔解温度Tm。Tm是指在该温度时,有50%的引物与其互补序列以双链DNA分子的形式存在。Tm是确定PCR退火温度的必要条件。合理的退火温度范围介于55°C到70°C之间。退火温度通常比引物的Tm低5°C。因为绝大多数公式提供的是预估的Tm值,所以这里的退火温度只是作为一个起始温度进行尝试。在逐渐增加退火温度的条件下进行多次反应并分析,可以增加PCR的特异性。
高GC含量的模板通常具有较高的熔解温度,在正常的反应条件下可能不能完全变性。
您可以尝试加入5%-10%的DMSO、至多10%的甘油或者1-2%的甲酰胺,或者联用这些方法促进这些难扩增模板的扩增。注意:使用助溶剂会降低您的引物的最佳退火温度。
退火温度相对较高时,您可以选择使用双温度实验方案。此时,退火和延伸步骤放在一起进行,例如两者都可在>62°C的温度下发生。相对常规的三温度实验方案(三步法),双温度实验方案的优势是速度快得多。
Value Oligos是最经济、快速的寡核苷酸订购方法。其可以选择5-40mer、25或50纳摩尔规格,同时包含了一系列可满足您需求的纯化选项,且可实现次日发货(仅适用于美国客户)。其订购费用按照每条寡核苷酸而不是每个碱基来计算。Value Oligos不提供修饰选项。Value Oligos与我们的标准寡核苷酸采用相同的生产流程,有着相同的质控标准。
因为随着寡核苷酸长度增加,在从正确的产物中分离出合成失败的寡核苷酸时,柱体纯化方法的效率会越来越低。在这种情况下,PAGE纯化是相对理想的选择。
Tm值并不是绝对的——它们是实际存在的熔解温度范围的一个近似值。对于一条给定的寡核苷酸,熔解温度不仅与盐的含量有关,也与碱基组成和在反应液中不能精确定量的引物浓度有关,熔解温度范围会存在10-15度的波动。您不应仅仅使用某个给定Tm值进行实验。Tm是指在该温度时,有50%的引物与其互补序列以双链DNA分子的形式存在。Tm是确定PCR退火温度的必要条件。合理的退火温度范围介于55°C到70°C之间。退火温度通常比引物的Tm低5°C。因为绝大多数公式提供的是预估的Tm值,所以这里的退火温度只是作为一个起始温度进行尝试。在逐渐增加退火温度的条件下进行多次反应并分析,可以增加PCR的特异性。
在整个平板形式的订单中,96孔板每板平均不少于24条寡核苷酸;384孔板每板平均不少于192条寡核苷酸。
对于25、50和 200 nmol的脱盐和柱体纯化的DNA寡核苷酸,100% 通过A260 分析进行质控。此外随机选取25%的寡核苷酸产物样品进行毛细管电泳或质谱检测。对于用户订购的25和50 nmol规格的脱盐DNA寡核苷酸,其分析过程中还100%执行实时数字三苯甲基监控。对于用户订购的1和10 μmols规格脱盐DNA寡核苷酸,全部规格的HPLC和PAGE纯化的DNA寡核苷酸,大多数含有3’端和/或5’端修饰的DNA寡核苷酸,以及RNA寡核苷酸都会100%执行 A260分析、毛细管电泳或质谱检测。
不,我们不保证有50/50的混合碱基。例如如果需要混合GC碱基,我们的合成仪会使用正常数量一半的G碱基和正常量一半的C碱基。这一计算并未将偶联效率考虑在内。因此,可能会出现30/70的碱基混合物。
仅限研究用途,不得用于诊断操作。