蛋白质染色剂支持 – 疑难解答

染色步骤中使用超过50%的酒精，会使凝胶脱水。只需将凝胶放在水中，使其再水化。

这可能与TCA未被洗干净有关，因为TCA会降低溶液的pH，引起染色剂聚集。我们建议先用大量水洗涤2次，每次5分钟，最后再用水洗涤1小时以上（如果需要，可以洗涤过夜）。或者，也可以使用过量的SimplyBlue™ SafeStain进行染色。

这最有可能是因为SDS的干扰。我们建议在开始染色前，彻底洗涤凝胶。

以下是可能原因和解决方案：

所有Coomassie蛋白质染色剂试剂都会形成染色剂-染色剂聚集物，Imperial™蛋白质染色剂含有可减慢聚集物形成速度的添加剂。如果不加以干涉，试剂会形成可见的聚集物并在瓶中沉淀；但是，轻轻混合可使这些聚集物完全散开。为了确保使用均匀分散的样品，应在倒出或配制试剂前将其轻轻混合。

这最有可能是因为SDS的干扰。我们建议增加染色前的凝胶洗涤次数和/或洗涤液体积。也可使用25%异丙醇/10%乙酸溶液或12%三氯乙酸将凝胶脱色5分钟。

以下是可能原因和解决方案：

这最有可能是因为蛋白转印出现问题。请确认转膜液和转印条件是正确的。

这最有可能是因为脱色时间不足。我们建议将膜放在30%乙腈/20%乙醇溶液中另外脱色5分钟。

如果采用NuPAGE™ Bis-Tris/Small Peptides实验方案，可能会使背景降低。该方案利用额外的固定步骤去除多余SDS；SDS可作为抗胶体试剂，使背景升高。染色液的低pH条件可固定凝胶，但固定速度没有NuPAGE™方案中的预固定步骤快。

• 低比例丙烯酰胺凝胶的背景较高，是因为这些凝胶具有较大的孔，胶体可渗入和停留在孔中。
• 去除背景的方法为，将凝胶放在25%甲醇溶液中孵育，直至获得干净的背景。应注意，这种方法也会去除一部分染色剂。
• 在浓度>25%的甲醇溶液中长时间孵育，可使蛋白质条带和背景完全脱色。

不，您看到的蓝色块状物被称为胶体。它们使染色剂能够有效染色。我们建议在使用前摇晃溶液，使瓶中的块状物均匀散开。

当胶体蓝Stainer A与Stainer B溶液混合时，可能会形成沉淀；轻轻摇晃30秒，沉淀即可溶解。

可能不会。但是，如果Stainer B溶液的加入量比要求加入的量少10%或更多，可能导致染色力度不足。加入过多的Stainer B溶液不会影响结果，Stainer A溶液增加/减少50%也不会影响结果。

胶体，或蓝色块状物，在这种染色操作中出现是正常的。但是，如果含量异常高，通常是因为甲醇加入量太少或未加入甲醇。

可以，您可以用水将凝胶完全脱色后从头开始染色操作，或者，如果您感觉染色力度还是有点低并且想要加深染色，可将凝胶直接放回染色液中。

丙烯酰胺浓度低于10%的凝胶，通常背景较高，因为低比例丙烯酰胺凝胶具有较大的孔，胶体可渗入和停留在这些孔中。去除多余背景的方法为，将凝胶放在25%甲醇溶液中孵育，直至获得干净的背景。应注意，这种方法也会去除条带上的部分染色剂。在浓度>25%的甲醇溶液中长时间孵育，可导致蛋白质条带和背景完全脱色。

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

冷冻的SilverXpress™银染试剂盒应该可以使用；之前的测试表明，冷冻的试剂盒性能不变。

以下是可能原因和解决方案：

• 上样孔中的污染物进入凝胶。上样前，使用1X电泳缓冲液冲洗上样孔5次或更多。
• 水质较差。应使用电阻率大于18 megohm/cm的超纯水制备溶液或冲洗。
• 制备试剂所用的设备污染——使用玻璃棒和灭菌移液管制备试剂。彻底洗涤玻璃器皿。

这可能是指尖或空气中的角蛋白污染物。我们建议在电泳和染色步骤中全程佩戴手套，并在上样前用超纯水或电泳缓冲液冲洗凝胶孔。

以下是可能原因和解决方案：

• 水质较差。应使用电阻率大于18 megohm/cm的超纯水制备溶液或冲洗。
• 染色托盘不干净或含有上次银染残留的溶液。使用银染专用托盘。银染后，用肥皂和水洗涤托盘，并用超纯水冲洗干净。
• 不同步骤之间的洗涤处理不恰当。不要跳过或减少任何洗涤步骤。
• 凝胶弯曲或撕裂。处理凝胶时应小心。电泳后，小心将凝胶从凝胶盒中取出，不要撕裂凝胶。
• 染色时，凝胶未完全浸没。应确保凝胶完全浸没在染色液中，所有步骤均使用旋转式摇床以使得染色更加均匀。

如果怀疑因不完全固定而丢失蛋白，可延长浸泡间隔时间。但是，过夜固定会削弱染色性能。如果不小心大量延长了固定时间，建议在显色后增加洗涤步骤，从而将后续干燥过程中发生凝胶破裂的可能性降至最低。

不能，凝胶过度染色是不可逆转的。如果将凝胶放在显色液中，凝胶颜色会持续加深，并在30分钟内变成黑色。所以，必须小心监测显色过程，并适时加入终止试剂。由于溶液是瞬时渗入凝胶的，所以加入终止试剂的时间可能需要稍早于达到所需条带染色强度的时间。特别是在蛋白上样量高的凝胶中，显色非常迅速。

如果溶液暂时变为棕色，然后又变透明，则属于正常情况（有时该过程非常快，观察不到）。但是，如果溶液保持为棕色，则表示用于混合染色剂的瓶子中存在污染物，通常是因为瓶中含有之前使用的溶液。

以下是可能原因和解决方案：

• 蛋白上样量较低。增加蛋白上样量。应确保蛋白上样量至少为1-5 ng。
• 水质较差。应使用电阻率大于18 megohm/cm的超纯水制备溶液或冲洗。
• 润洗时，所用水的体积不正确。所有成分都应精确量取，并严格遵守实验方案。
• 染色液或显色液的制备不恰当。假设上样量充足，则染色失败最可能是因为银染液或显色液的制备不恰当。如果加入显色液后5分钟未观察到条带，我们建议在染色托盘中直接加入5 mL显色液。应确保使用超纯水正确制备溶液。

可尝试使用硫代硫酸盐（也被称为“法梅减薄液”）降低背景。但是，它也会使条带脱色，所以，应稀释浓度。若凝胶在终止液中的浸泡时间超过推荐时间，同样也会降低背景和条带染色强度。

通常，Tricine凝胶的背景染色会稍高于Tris-甘氨酸凝胶。与Tris-甘氨酸凝胶相比，Tricine凝胶中相对较高的溶质浓度可能会减慢溶液进入凝胶的速度。为解决该问题，可延长敏化步骤中的浸泡时间（可过夜），然后再继续后续步骤。

使用以下视觉线索作为正确完成每一步的标志：

• 敏化步骤完成后，低比例浓缩胶与分离胶相比出现白色不透明物[状]，表明这一步正确完成。
• 敏化步骤后第一次水洗时，小型凝胶卷曲成圆柱形并漂在液面。
• 同时加入Stainer A和Stainer B时，形成短暂可见的棕色沉淀。这种棕色沉淀短暂出现后消失，表明染色液正确混合。如果棕色不褪去，则丢弃溶液，并在干净的玻璃器皿中重新配置混合液。

这通常是因为蛋白上样量过多。我们建议降低每条条带的蛋白上样量。对于未知蛋白，为了确定最佳上样量，可能需要进行连续稀释。

以下是可能原因和解决方案：

• 未在适当时间将终止液加到凝胶上。加入终止试剂的时间应稍早于达到所需条带染色强度的时间。
• 蛋白上样量过多。降低凝胶上的蛋白上样量。

以下是可能原因和解决方案：

• 样品中含有高浓度的DTT（>50 mM）。使用30–50 mM DTT还原样品。
• 为防止出现拖尾现象，按以下步骤将样品还原和烷基化：使用新配制的DTT（终浓度为17 mM）还原样品，并在70℃加热样品10分钟。随后，使用新配制的碘乙酰胺（终浓度为35 mM）将样品烷基化，并在70℃加热样品10分钟。在还原和烷基化后的样品中加入不含DTT的SDS样品缓冲液，随后进行电泳和银染。
• 敏化剂中含有硫黄素。我们建议在敏化步骤后，先将30%乙醇洗液在微波炉中加热，然后再加到凝胶中，并稍微延长水洗时间。您可在使用turbo方法时尝试上述操作，但是存在损失敏化剂效果的风险。

以下是可能原因和解决方案：

• 水质较差。应使用电阻率大于18 megohm/cm的超纯水制备溶液或冲洗。
• 染色托盘不干净或含有上次银染残留的溶液。使用银染专用托盘。银染后，用肥皂和水洗涤托盘，并用超纯水冲洗干净。
• 不同步骤之间的洗涤处理不恰当。不要跳过或减少任何洗涤步骤。
• 凝胶弯曲或撕裂。处理凝胶时应小心。电泳后，小心将凝胶从凝胶盒中取出，不要撕裂凝胶。
• 染色时，凝胶未完全浸没。应确保凝胶完全浸没在染色液中，所有步骤均使用旋转式摇床以获得均匀染色。

以下是可能原因和解决方案：

• 凝胶中的银离子流失。将染色后的洗涤时间限制在30-60秒内。
• 染色液或显色液的配制不恰当。应使用超纯水正确配制溶液。
• 蛋白上样量过低。增加蛋白上样量。上样量应至少为1-5 ng。

以下是可能原因和解决方案：

• 未在适当时间将终止液加到凝胶上。加入终止试剂的时间应稍早于达到所需条带染色强度的时间。
• 蛋白上样量过多。降低凝胶上的蛋白上样量。

这可能是指尖或空气中的角蛋白污染物。我们建议在电泳和染色步骤中全程佩戴手套，并在上样前用超纯水或电泳缓冲液冲洗凝胶孔。

以下是可能原因和解决方案：

• 蛋白上样量过低。增加蛋白上样量。上样量应至少为1-5 ng。
• 有些蛋白质可能需要较长的固定时间。将凝胶的固定时间延长至2小时或过夜。

这通常是因为蛋白上样量过多。我们建议降低每条条带的蛋白上样量。对于未知蛋白，为了确定最佳上样量，可能需要进行连续稀释。

条带周围的阴影表示由SDS造成了较高的染色背景。将凝胶放在10%甲醇/7%乙酸中脱色稍微久一点，约延长30分钟，然后用水彻底洗涤。为更好地去除凝胶上的SDS并降低起始背景染色，应在以后的实验中尝试延长凝胶固定时间，约增加30分钟。

SYPRO™ Ruby蛋白质凝胶染色剂保存超过一年会不稳定。染色剂溶液会逐渐析出沉淀（自聚集），对蛋白条带的染色力度降低，导致凝胶表面的“碎片”或“斑点”增多。由于染色剂会粘在大部分滤纸和滤膜上，因此无法通过过滤从染色剂溶液中除去沉淀。

SYPRO™ Ruby蛋白质凝胶染色剂存放时间越久，凝胶上的斑点越多，这是因为SYPRO™ Ruby染色剂会随时间而发生自聚集。染色剂聚集在染色剂容器、溶液中的污染物或来自空气或手套的颗粒物（包括皮肤和空气中的角蛋白）周围，也会形成斑点。若使用SYPRO™ Ruby蛋白质凝胶染色剂孵育凝胶数小时或更长时间，染色剂会在容器边缘积累并随着容器的持续摆动而移动，特别是在脱色步骤中，从而形成斑点。灰尘、头发、手套粉末或掉落在凝胶或玻璃成像板上的衣服线头中的自发荧光颗粒物，在成像时也会形成非染色剂斑点。成像仪对凝胶表面特征的聚焦越好，形成的可见斑点越多。

为了将斑点形成和其他背景碎片数量降至最低，应保持实验室卫生整洁，使用电阻率大于18 megohm/cm的超纯水制备溶液，接触凝胶前用水冲洗掉手套上的粉末，使用无尘擦布并穿上实验服或者不要穿可产生大量线头的衣服，每次使用时都用乙醇冲洗染色容器并在下次使用前擦掉所有残留染色剂，每次放置凝胶前用乙醇和水冲洗和擦净玻璃成像表面。在染色和洗涤步骤之间，用乙醇擦掉染色托盘表面积累的染色剂。快速染色步骤应在90分钟内完成，这样可防止大部分斑点的形成。一旦斑点沉积在凝胶表面后，无法将其洗掉。

在凝胶3D图像中，斑点会呈现为较高的尖峰。这些斑点与蛋白质斑点或条带的3D图像看起来不同。一些图像分析软件包具有降噪算法，可轻松识别和去除这类像素化噪音。

出现这些斑点是因为IEF样品缓冲液中的某些成分在二维分离时进入凝胶，并被SYPRO™ Ruby蛋白质凝胶染色剂染色。SYPRO™ Ruby染色剂会被胺类物质吸引，如多肽的赖氨酸、精氨酸和组氨酸中的胺，以及去污剂和两性电解质中的胺。最简单的解决方法是使用一种不会产生这种斑点的其他IEF缓冲液配方。或者，使用50%甲醇/7%乙酸过夜固定，可洗掉污染物。

蓝色染色剂会吸收红色波长的光，所以它们会吸收SYPRO™ Ruby染色剂的红色荧光。SYPRO™ Ruby染色剂也会与这些蛋白结合，但其信号会被有色染色剂淬灭，导致阴性染色并产生黑色条带。含蓝色蛋白的分子量标记物淬灭SYPRO™ Ruby荧光的实例是，BenchMark™预染蛋白Ladder和SeeBlue™ Plus2预染标准品中的一些蛋白质。若溴酚蓝染色剂在电泳时未完全脱离凝胶，也会出现相同的现象，经SYPRO™ Ruby染色的凝胶随后使用Coomassie Blue染色剂染色时也会发生信号丢失。大部分其他有色染色剂不会淬灭SYPRO™ Ruby染色剂的信号，能够得到正常的蛋白染色条带。

您的样品或凝胶上样孔可能被皮肤或头发中的角蛋白污染。应在上样前用超纯水或电泳缓冲液冲洗凝胶孔。制备样品时，应穿戴实验服和手套；制备样品时，应使用保存于密封塑料袋中而非摆放在实验台上的微量离心管。

这可能是因为样品中的蛋白质含量很低或无蛋白质。请检测原始样品中的蛋白浓度。

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

• 在膜的某一部位，蛋白浓度较高。降低转印凝胶中的蛋白浓度。
• 在某些情况下，经DTT还原的蛋白质可能无法完全清除。可将Eraser溶液的孵育时间延长至5分钟。

这可能是因为存在去污剂。染色时，应使用干净的托盘。下游处理，如免疫检测，应单独使用一个托盘。

我们建议完成清除步骤，然后再次进行膜染色，并继续完成余下的实验操作。

以下是可能原因和解决方案：

• 染色不充分。应使用适合所用凝胶类型的染色方案。使用BenchMark™ His标签蛋白质标准品作为阳性对照，对染色试剂和方案进行验证。避免过度洗涤凝胶。
• 凝胶显色或成像不恰当。应使用带有照相机的紫外透照仪和具有正确滤镜的激光扫描仪（详情见使用手册）进行凝胶成像。不建议使用Polaroid™照相机。应确保照相机光圈打开并有足够的光进入，并且照相机应连接到可调整对比度的成像软件上，从而获得最佳的图像。完成洗涤步骤后，应立即对凝胶成像。将凝胶保存在磷酸盐缓冲液中，会降低信号强度。

蛋白上样量或表达水平较低。应使用总蛋白染色剂对凝胶进行染色，检测凝胶的总蛋白含量（见使用手册第13页）。至少上样1 pmole的His标签融合蛋白进行检测。应确保His标签是框内融合[读码框正确]，并且蛋白表达正常。

以下是可能原因和解决方案：

• 遗漏了洗涤步骤。应使用20 mM磷酸盐缓冲液洗涤凝胶2次。如果背景很高，应进行第3次水洗并洗涤10分钟。
• 水质较差。应使用超纯水（电阻率大于18 megohm/cm）洗涤和制备磷酸盐缓冲液。
• 蛋白质上样量过多。降低蛋白浓度或减少上样体积。
• 成像平台不干净。每次进行凝胶成像前都应使用纸巾清洁成像系统，以最大程度的降低背景荧光。
• 非特异性条带。强碱性蛋白和二价金属结合蛋白，如碳酸酐酶（30 kDa）、SlyD（21 kDa）和磷酸化酶 B（97 kDa），可与染色剂发生交叉反应，产生非特异性条带。 

这可能是因为曝光过度——为检测低表达水平的目标蛋白而加长曝光时间，可能导致BenchMark™ His标签蛋白标准品中的微量污染物显色。可降低BenchMark™ His标签蛋白标准品的上样量，或者先以较短的曝光时间对标准品进行成像，然后以较长的曝光时间对低表达水平蛋白进行成像。

以下是可能原因和解决方案：

• 标记不恰当。为获得最佳结果，应正确遵循标记方案。应确保在电泳前将Lumio™绿色检测试剂加到样品中。避免Lumio™凝胶样品缓冲液（4X）暴露于空气中。为保持缓冲液的活性，应在每次使用后立即将Lumio™绿色检测试剂和Lumio™增强剂放回-20℃。
• 蛋白上样量较低或表达水平较低。应按照使用手册的建议，使用总蛋白染色剂对凝胶进行染色，检测凝胶上的总蛋白含量。至少上样1 pmole的Lumio™融合蛋白。应确保Lumio™标签是框内融合，并且蛋白表达正常。阳性对照与Lumio™载体一起提供，以验证蛋白是否表达。
• 凝胶长时间暴露于紫外光。Lumio™绿色试剂的荧光染色剂对光敏感，所以应避免凝胶长时间暴露于紫外光。
• 凝胶未立即显色或成像不恰当。应在从凝胶盒中取出凝胶后进行显色，并在电泳后立即成像。应按着说明书上的建议，使用紫外透照仪或具有合适滤镜的激光扫描仪进行成像。
  
  提示：如果您使用BenchMark™荧光蛋白标准品在相同凝胶上电泳并且能够在凝胶上对标准品条带进行成像，则表示凝胶成像是正确的。

以下是可能原因和解决方案：

• 凝胶处理不恰当或成像平台不干净。处理凝胶或凝胶成像时，不要用手直接接触凝胶。为将所有背景荧光降至最低，每次进行凝胶成像前都应使用纸巾清洁成像系统。
• 蛋白上样量过多。降低蛋白浓度或减少上样体积。
• 非特异性结合。为将非特异性结合降至最低，应使用Lumio™胶内检测增强剂。大肠杆菌裂解物中的某些蛋白（SlyD，21 kDa）和哺乳细胞培养基中的牛血清白蛋白（BSA，66 kDa），会与Lumio™绿色试剂发生交叉反应，产生非特异性结合。移除细胞培养基，收获细胞后使用PBS洗涤哺乳细胞3-4次，从而使BSA的非特异性结合降至最低。

以下是可能原因和解决方案：

以下是可能原因和解决方案：

这可能是由于含组氨酸簇的蛋白发生了较弱的交叉反应染色。以下是我们的建议：

• 延长凝胶水洗时间（第5步）
• 稍微缩短染色时间（第2步）
• 为了将较弱的非特异性染色降至最低，应调整曝光时间和其他设置。

为了使Pro-Q™ Diamond磷酸化蛋白凝胶染色剂正常工作，应在电泳前按着说明书中步骤进行氯仿/甲醇沉淀操作，将样品进行去脂化和脱盐处理。Pro-Q™ Diamond染色剂也能与磷脂结合，而反离子和高盐浓度可遮盖染色剂与磷酸盐的电荷相互作用。

为获得最佳染色特异性，应除去凝胶上的所有SDS和固定剂。固定步骤可除去SDS，水洗步骤可除去固定剂。为确保除去所有SDS和固定剂，有必要进行多次固定及多次水洗。在固定和水洗步骤中，较大的或较厚的凝胶可能需要更多的溶液或更长的孵育时间，或者也可以进行微波染色。

可能需要延长凝胶的脱色时间。将凝胶放回到脱色液中继续孵育，直到PeppermintStick™标准品泳道中只能看到2条条带。

这表示Pro-Q™ Diamond染色剂已降解，应丢弃染色液。可能是因为染色剂已超过保质期或在保存期间过多暴露于室内灯光。暴露于室内灯光会使染色剂分子逐渐降解，切割磷酸盐结合部分，将染色剂变为非特异性蛋白染色剂。这会发生在染色剂光漂白之前，但是整体信号会比非降解染色剂的特异性信号弱。染色后的凝胶不太可能被保存，但您可尝试通过重复过夜固定步骤而完全去除染色剂，通过水洗去除固定剂，然后使用新的Pro-Q™ Diamond磷酸化蛋白凝胶染色剂再次染色。

许多总蛋白染色剂，包括SYPRO™ Ruby凝胶染色剂和Coomassie™ Blue染色剂，会使Pro-Q™ Diamond信号淬灭。如果您在使用Pro-Q™ Diamond染色剂对凝胶或印迹膜进行染色时，使用了之前用于总蛋白染色剂的容器，则染色托盘中残留的总蛋白染色剂可能会污染您的凝胶。染色时应使用新的容器（如塑料称量船），每种染色剂使用指定容器，或用乙醇彻底冲洗容器并用Kimwipe™纸巾擦去所有残留物。

在步骤2.5氧化溶液孵育中，使用高碘酸盐过度氧化会导致非糖基化蛋白发生较强的非特异性染色。标准小型凝胶或印迹膜的孵育时间不要超过30分钟，大型2D凝胶不要超过1小时，或者不要使用超过推荐浓度的高碘酸盐。

如果CandyCane™标准品和待测糖蛋白被正确染色，则表示试剂盒能正常工作。一些丰度非常高的蛋白，如血清和血浆中的白蛋白，会被轻微染色。Pro-Q™ Emerald染色剂与糖基共价结合，所以，染色后多洗涤有助于去除非共价结合染色剂。在Pro-Q™ Emerald染色剂然后后再使用总蛋白染色剂（如SYPRO™ Ruby蛋白质凝胶染色剂）进行染色，可检测高丰度所致的非特异性染色。也就是说，一些蛋白质实际上在天然状态下被大量氧化，而这种羰基化会被Pro-Q™ Emerald试剂染色。无氧化步骤的Pro-Q™ Emerald染色，能够区分氨基酸的羰基化与糖基化。在这些条件下，CandyCane™标记物泳道不会被染色，但羰基化蛋白会被染色。

来自Tris或甘氨酸的伯胺，可导致染色结果较差，并且会与高碘酸盐氧化生成的醛基/酮基反应。这有效覆盖了反应基团，使Pro-Q™ Emerald染色剂无可结合的活性位点。为了除去所有胺污染物，应增加新鲜固定液的孵育体积或孵育次数，并增加洗涤缓冲液的体积或洗涤次数。

未充分去除高碘酸氧化溶液也可能导致染色结果较差。为了充分去除高碘酸，应在氧化步骤后增加洗涤液体积或洗涤次数。

糖蛋白糖基的氧化不充分也可能导致染色结果较差。应增加高碘酸氧化溶液的体积。

注意：对于小型凝胶，高碘酸氧化的次数或孵育时间不可超过30分钟。过多的高碘酸氧化可导致非糖基化蛋白的染色增加。

使用Pro-Q™ Emerald糖蛋白凝胶染色剂进行染色时，为获得最佳的染色信号和灵敏度，大型凝胶、非常厚或非常高比例的丙烯酰胺凝胶通常需要更多的孵育或洗涤步骤。

许多总蛋白染色剂，包括SYPRO™ Ruby凝胶染色剂和Coomassie™ Blue染色剂，会使Pro-Q™ Emerald信号淬灭。如果您在使用Pro-Q™ Emerald染色剂对凝胶或印迹膜进行染色时，使用了之前用于总蛋白染色剂的容器，则染色托盘中残留的总蛋白染色剂可能会污染您的凝胶。染色时应使用新的容器（如塑料称量船），每种染色剂使用指定容器，或用乙醇彻底冲洗容器并用Kimwipe™纸巾擦去所有残留物。

Pro-Q™ Emerald染色剂存放时间越久，染色剂斑点越多，特别是Pro-Q™ Emerald 300染色剂，这是因为染色剂会随时间而发生自聚集。染色剂与染色剂容器、溶液中的污染物或来自空气或手套的颗粒物结合，也会形成斑点。灰尘、头发、手套粉末或掉落在凝胶或玻璃成像板上的衣服线头中的自发荧光颗粒物，在成像时也会形成非染色剂斑点。成像仪对凝胶表面特征的聚焦越好，形成的可见斑点越多。

为了将斑点形成和其他背景碎片数量降至最低，应保持实验室整洁卫生，使用电阻率大于18 megohm/cm的超纯水制备溶液，接触凝胶前用水冲洗掉手套上的粉末，使用无尘擦布并穿上实验服或者不要穿可产生大量线头的衣服，每次使用时都用乙醇冲洗染色容器并在下次使用前擦掉所有残留染色剂，每次放置凝胶前用乙醇和水冲洗和擦净玻璃成像表面。在染色和洗涤步骤之间，用乙醇擦掉染色托盘表面积累的染色剂。斑点沉积在凝胶表面后，无法将其洗掉。当分析接近检测限的大量糖蛋白时，我们建议将样品放在凝胶的中间泳道进行电泳。

在凝胶3D图像中，斑点会呈现为较高的尖峰。这些斑点与蛋白质斑点或条带的3D图像看起来不同。一些图像分析软件包具有降噪算法，可轻松识别和去除这类像素化噪音。

使用Pro-Q™ Emerald糖蛋白凝胶染色剂对Novex™ NuPAGE™ Bis-Tris和Tris-Acetate凝胶染色时，可能会得到高背景染色，特别是与MES电泳缓冲液结合使用或使用接近有效期限的凝胶时[临近过期的凝胶时]。凝胶背景会随丙烯酰胺密度的增加而增加，梯度凝胶从上到下的背景逐渐增强，与丙烯酰胺梯度相对应。增加洗涤次数或改进孵育时间将有助于降低背景。使用Tris-甘氨酸或Tricine凝胶，会得到更好的结果。如果想继续使用Pro-Q™ Emerald染色剂对Novex™ NuPAGE™ Bis-Tris凝胶进行染色，我们建议使用近期购买的凝胶和MOPS电泳缓冲液。在高背景的凝胶中，仍然能够检测到糖蛋白，但灵敏度降低。

以下是可能原因和解决方案：

这可能是因为染色时间过长。我们建议将染色时间缩短30秒或1分钟。

以下是可能原因和解决方案：