免疫印迹分析检测支持 - 入门

iBind™蛋白质免疫印迹系统是一台自动化免疫检测设备。该设备无需外接电源，利用机械压力使免疫检测试剂发生顺序侧流（SLF），从而自动完成免疫印迹检测中所有的封闭、抗体孵育和洗涤步骤。

有两种iBind™蛋白质免疫印迹系统可供选择：包括1）传统iBind™蛋白质印迹设备，可容纳1块小型印迹膜，以及2）iBind™ Flex蛋白质印迹设备，可同时容纳1或2块小型印迹膜、1块中型印迹膜或最多6块垂直剪切膜条（用于不同抗体）。

iBind™蛋白质免疫印迹系统（货号SLF1000）由以下组件构成：

• iBind™蛋白质印迹设备
• iBind™印迹滚筒
• iBind™观察窗盖

下列物品需单独购买：

• iBind™卡片（货号SLF1010）
• iBind™溶液试剂盒（货号SLF1020），制备用于化学发光或发光检测的封闭、稀释和洗涤缓冲液
• iBind™荧光检测溶液试剂盒（货号SLF1019），制备用于荧光检测的封闭、稀释和洗涤缓冲液
• Novex™ AP小鼠化学发光检测试剂盒（货号SLF1021）或Novex™ AP兔化学发光检测试剂盒（货号SLF1022）

我们不建议使用您自己的溶液。iBind™溶液和iBind™荧光检测（FD）溶液具有特殊的粘稠度，并且针对iBind™蛋白质免疫印迹系统的顺序侧流原理进行了优化。我们不能对任何其他溶液的性能进行保证。

可以，小于9 cm x 9 cm的膜可以用于iBind™蛋白质免疫印迹系统。建议将膜条或更小的印迹膜放在设备中心。使用尺寸较大的膜时，必须确保膜的任何部分都没有与iBind™卡片上的膜组接触。

将膜置于iBind™溶液/ iBind™荧光检测（FD）溶液中浸泡至制备抗体稀释液之前，足以完成对膜的封闭。不需要将膜在封闭液中封闭过夜。加入一抗之前，膜会在iBind™溶液/ iBind™荧光检测（FD）溶液中额外受到封闭。

• 每次使用后，用流水冲洗iBind™蛋白质印迹设备，在下一次使用前将设备晾干。不建议使用去污剂，因为残留的去污剂可能会干扰结果。
• 为延长iBind™蛋白质印迹设备弹簧的使用寿命，保存设备时应将弹簧锁解锁，并打开盖子，如使用手册第23页所示。

如果PVDF膜是干燥的，则在浸泡于在iBind™溶液/ iBind™荧光检测（FD）溶液之前，需要使用100%甲醇预活化，并用蒸馏水润洗。刚刚转印完毕并转移至在iBind™溶液/ iBind™荧光检测（FD）溶液中的PVDF膜无需活化。

当使用iBind™蛋白质免疫印迹系统和LI-COR™ Odyssey™成像系统时，请采用使用手册第13页的实验方案。我们不建议使用LI-COR™溶液。

iBind™ Flex蛋白质免疫印迹系统（货号SLF2000）由以下组件构成：

• iBind™ Flex蛋白质印迹设备
• iBind™ Flex中型插槽
• iBind™ Flex小型插槽
• iBind™ Flex多膜条插槽
• iBind™ Flex印迹滚筒

下列物品需单独购买：

• iBind™ Flex卡片（货号SLF2010）
• iBind™ Flex溶液试剂盒（货号SLF2020），制备用于化学发光或发光检测的封闭、稀释和洗涤缓冲液
• iBind™ Flex荧光检测溶液试剂盒（货号SLF2019），制备用于荧光检测的封闭、稀释和洗涤缓冲液
• Novex™ AP小鼠化学发光检测试剂盒（货号SLF1021）或Novex™ AP兔化学发光检测试剂盒（货号SLF1022）

我们不建议使用您自己的溶液。iBind™ Flex溶液和iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液具有特殊的粘稠度，并且针对iBind™ Flex蛋白质免疫印迹系统的顺序侧流原理进行了优化。我们不能对任何其他溶液的性能进行保证。

将膜置于iBind™ Flex溶液/ iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液中浸泡至制备抗体稀释液之前，足以完成对膜的封闭。不需要将膜在封闭液中封闭过夜。加入一抗之前，膜会在iBind™ Flex溶液/ iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液中额外受到封闭。

• 每次使用后，用流水冲洗iBind™ Flex插槽，在下一次使用前将插槽晾干。
• 小心处理插槽。
• 将未使用的插槽保存于iBind™ Flex蛋白质印迹设备的抽屉中。
• 为延长iBind™ Flex蛋白质印迹设备弹簧的使用寿命，保存设备时应将弹簧锁解锁，并打开盖子，如使用手册第28页所示。

如果PVDF膜是干燥的，则在浸泡于iBind™ Flex溶液/ iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液之前，需要使用100%甲醇预活化，并用蒸馏水润洗。刚刚转印完毕并转移至在iBind™ Flex溶液/ iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液中的PVDF膜无需活化。

我们可提供iBind™ Flex溶液试剂盒和iBind™ Flex荧光检测（FD）试剂盒。对于标准化学发光或发光检测，我们建议使用iBind™ Flex溶液试剂盒（货号SLF2020）；对于荧光检测，我们建议使用iBind™ Flex荧光检测（FD）试剂盒（货号SLF2019）。

当使用iBind™ Flex蛋白质免疫印迹系统和LI-COR™ Odyssey™成像系统时，请采用使用手册第14页的实验方案。我们不建议使用LI-COR™溶液。

可以。无论是否使用小型或多膜条插槽，空孔都应与卡片保持接触，应用水填充以确保所有溶液流过卡片。

适用，可转印单张小型印迹膜或最多3块垂直剪切膜条。但是，当使用小型或多膜条插槽时，未与卡片接触的孔应为空的。

不建议这样使用，从顶部到底部不均匀流动产生的电势，可能导致穿过水平剪切膜条产生梯度信号强度。

两种标准和荧光检测溶液的配方是相同的。唯一的不同点是产品供应量不同，iBind™ Flex溶液试剂盒足够供10块中型、20块小型或60块垂直剪切膜条使用。

除了iBind™ Flex卡片的宽度是iBind™卡片的1.7倍之外，iBind™ Flex卡片背面还印有对齐线，它们会在加入溶液时出现，有助于正确水平摆放多张小型或垂直剪切膜条。

容易。该设备具有直观的磁性设计，用户更换插孔非常简单。但是，我们强烈建议用户在更换或洗涤时，小心处理插孔（按插槽上的指示操作），其他两个插孔在不使用时应保存在底部的托盘中。

如果PVDF膜是干燥的，则在浸泡于iBind™溶液/ iBind™荧光检测（FD）溶液之前，需要使用100%甲醇预活化，并用蒸馏水润洗。刚刚转印完毕并转移至在iBind™溶液/ iBind™荧光检测（FD）溶液中的PVDF膜无需活化。

We offer the iBind™ Solution kit and the iBind™ Fluorescent Detection (FD) Solution kit. For standard chemiluminescent or chromogenic detection, we recommend the iBind™ Solution kit (Cat. No. SLF1020) and for fluorescent detection, we recommend the iBind™ Fluorescent Detection (FD) Solution kit (Cat. No. SLF1019).

我们提供以下3种WesternBreeze™ 显色法检测试剂盒：

• WesternBreeze™ 显色法检测试剂盒：抗鼠，货号WB7103
• WesternBreeze™ 显色法检测试剂盒：抗兔，货号WB7105
• WesternBreeze™ 显色法检测试剂盒：抗山羊，货号WB7107

可以，您可单独购买发光显色底物（货号WP20001）。它会是紫色的显色沉淀物。

Novex™ AP显色底物（BCIP/NBT）和Novex™ HRP显色底物（TMB）是即用型的单一成分底物，可在免疫印迹膜或点印迹膜上分别对碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）进行灵敏的免疫检测。AP底物的灵敏度在100 pg范围内，HRP底物在1 ng范围内。

Novex™ AP发光显色底物由5-溴-4-氯-3-吲哚基-1-磷酸盐（BCIP）和硝基四氮唑蓝（NBT）的即用型溶液组成，与碱性磷酸酶反应可形成黑紫色沉淀。该底物可作为独立商品（货号WP20001）购买，也是WesternBreeze™发光显色法检测试剂盒的一个组分。

Novex™ HRP显色底物由3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）的即用型无毒溶液组成，与辣根过氧化物酶反应可形成蓝色沉淀。该底物可作为独立产品（货号WP20004）购买。

*注意：使用不同的抗原和抗体进行检测，灵敏度也不同。

对于蛋白质免疫印迹，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转印到硝化纤维素或PVDF膜上后，立即使用20 mL纯水洗膜2次，每次5分钟，从而除去部分凝胶和转移缓冲液成分以及弱结合蛋白质。随后，膜可立即用于WesternBreeze™显色法免疫检测实验。

或者，将洗过的膜放在一张干净的滤纸上，在微热气流或红外灯下蒸干。适当干燥的膜可在4℃的密封容器内保存7天，保存时间取决于抗原。经水洗和干燥的硝化纤维素膜可立即用于WesternBreeze™显色法免疫检测实验方案。但是，经水洗和干燥的PVDF膜需要在甲醇中再润湿，随后用20 mL水洗涤2次，每次5分钟，最后用于WesternBreeze™显色法免疫检测实验。

对于非变性PAGE蛋白质免疫印迹，建议在所有洗涤步骤前实施干燥步骤，改善蛋白质与膜的结合。干燥后，应使用20 mL水将硝化纤维素膜洗涤2次，每次5分钟，然后再用于WesternBreeze™发光显色法免疫检测实验方案。干燥的PVDF膜需要在甲醇中再润湿，随后用20 mL水洗涤2次，每次5分钟，最后用于WesternBreeze™显色法发光免疫检测实验。

可以，您可使用以下货号单独购买这些产品：

• 货号WB7003（抗体洗涤液）
• 货号WB7001（封闭液/稀释液A）
• 货号WB7002（封闭液/稀释液B）
• 货号WB7050（封闭液/稀释液A & B组合装）

AP连接的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗溶液可作为独立产品（货号WP20006和WP20007）购买，但是，AP连接的兔抗山羊二抗溶液不可作为独立产品购买。

对于蛋白质免疫印迹，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转印到硝化纤维素或PVDF膜上后，立即使用20 mL纯水洗膜2次，每次5分钟，从而除去部分凝胶和转移缓冲液成分以及弱结合蛋白质。随后，膜可立即用于WesternBreeze™化学发光免疫检测实验。

或者，将洗过的膜放在一张干净的滤纸上，在微热气流或红外灯下蒸干。适当干燥的膜可在4℃的密封容器内保存7天，保存时间取决于抗原。经水洗和干燥的硝化纤维素膜可立即用于WesternBreeze™化学发光免疫检测实验方案。但是，经水洗和干燥的PVDF膜需要在甲醇中再润湿，随后用20 mL水洗涤2次，每次5分钟，最后用于WesternBreeze™化学发光免疫检测实验。

对于非变性PAGE蛋白质免疫印迹，建议在所有洗涤步骤前实施干燥步骤，改善蛋白质与膜的结合。干燥后，应使用20 mL水将硝化纤维素膜洗涤2次，每次5分钟，然后再用于WesternBreeze™化学发光免疫检测实验方案。干燥的PVDF膜需要在甲醇中再润湿，随后用20 mL水洗涤2次，每次5分钟，最后用于WesternBreeze™化学发光免疫检测实验。

可以，您可使用以下货号单独购买这些产品：

• 化学发光底物，货号WP20002
• 化学发光底物增强剂，货号WP20003

Novex™ AP化学发光底物（CDP-Star™）和Novex™ ECL学发光底物是非放射性底物，可在免疫印迹膜或点印迹膜上分别用于对碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化物酶（HRP）进行化学发光免疫检测。Novex™化学发光底物的检测灵敏度高于沉淀型发光底物。利用X射线胶片或成像设备，可使检测达到皮克级别。

Novex™ AP化学发光底物是由一种二氧杂环丁烷底物CDP-Star™的即用型溶液组成，可用于检测碱性磷酸酶。Novex™ AP化学发光底物增强剂是由Nitro-Block-II™的20X溶液组成，在检测硝化纤维素膜上的印迹时，将增强剂与AP化学发光底物混合。增强剂不可用于PVDF膜，否则会产生高背景。膜孵育后20分钟，底物即可发光，并在45-60分钟达到峰强度。发光的最大波长为461–466 nm，并且可持续几小时，有些情况下可持续几天。Novex™ AP化学发光底物和Novex™AP化学发光底物增强剂可作为独立产品（货号WP20002和WP20003）购买，同时，它们也是WesternBreeze™化学发光检测试剂盒的组分。

Novex™ ECL化学发光底物试剂盒由两部分试剂组成，包括鲁米诺溶液和增强剂，可用于检测辣根过氧化物酶。用于印迹膜检测前，将试剂A和试剂B等体积混合。Novex™ ECL化学发光底物的发光强度在膜孵育后5-30分钟达到峰值，并在数小时内缓慢下降。

可以，您可使用以下货号单独购买这些产品：

• 货号WB7001（封闭液/稀释液A）
• 货号WB7002（封闭液/稀释液B）
• 货号WB7050（封闭液/稀释液A & B组合装）
• 货号WB7003（抗体洗涤液）

AP连接的山羊抗鼠和山羊抗兔二抗溶液可作为独立产品（货号WP20006和WP20007）购买，但是，AP连接的兔抗山羊二抗溶液不可作为独立产品购买。

不可以，这些SuperSignal™底物需要不同的稀释方法。如果您将SuperSignal™ West Pico化学发光底物实验方案用于SuperSignal™ West Dura化学发光底物，将导致高背景或信号强度降低和/或持续时间缩短。SuperSignal West Dura化学发光底物必须使用较少的（较稀的）一抗和二抗（见产品说明书中的推荐范围）。

SuperSignal™ West Dura化学发光底物的灵敏度比GE Healthcare ECL底物或Thermo Scientific™ Pierce™ ECL底物（货号32106）高10倍。SuperSignal™ West Dura化学发光底物的灵敏度也显著高于碱性磷酸酶的化学发光底物。

是，也不是。牛奶的生物素含量是可变的，因此不可用于抗生物素蛋白/生物素检测系统。牛奶的磷蛋白含量也是可变的，因此可能干扰抗磷酸酪氨酸过程。有多种封闭剂溶液可兼容SuperSignal™化学发光底物。

背景是一种相对的现象——没有一种封闭剂总是能够防止所有相互作用的发生。尽管一种特殊的封闭剂可能会在一组反应条件下产生完美的信噪比，但可能对另一组相似条件无效。关键在于通过改变封闭条件对系统进行优化。

有。在涉及辣根过氧化物酶（HRP）的检测步骤期间和之后，应避免使用叠氮化钠，因为它会抑制HRP活性。硫化物、氰化物、氟化物和超氧离子也会在一定程度上抑制HRP。

SuperSignal™ West Dura化学发光底物的检测下限为中飞克级（1 x 10^–15）。

尽管使用化学发光底物检测过的印迹膜可剥离并再次检测，但是，有些抗原/抗体系统对剥离步骤较为敏感，剥离后的印迹膜可能不会产生与新印迹膜质量相同的结果。只有经过实际实验，才能知道某个系统是否可进行再次检测。

请查看“技术贴士#23：剥离和再次检测免疫印迹膜”中的实验方案。

硝化纤维素和PVDF膜的效果都很好，但是硝化纤维素膜在一些应用中比PVDF膜更合适。此外，对于这种底物，荷电尼龙膜效果较好。

不可以，这些SuperSignal™底物需要不同的稀释方法。如果您将SuperSignal™ West Pico化学发光底物实验方案用于SuperSignal™ West Femto化学发光底物，将导致高背景或信号强度降低和/或持续时间缩短。SuperSignal West Femto化学发光底物必须使用较少的（较稀的）一抗和二抗（见产品说明书中的推荐范围）。

SuperSignal™ West Femto化学发光底物的灵敏度比GE Healthcare ECL底物或Thermo Scientific™ Pierce™ ECL底物（货号32106）高25-50倍。SuperSignal™ West Femto化学发光底物的灵敏度也显著高于碱性磷酸酶的化学发光底物。

SuperSignal™ West Femto化学发光底物的检测下限为低飞克级（1 x 10^–15）。

不可以，SuperSignal™底物需要不同的稀释方法，并在印迹膜上孵育5分钟。SuperSignal™ West Pico化学发光底物必须使用较少的（较稀的）一抗和二抗（见产品说明书中的推荐范围）。请查看技术贴士#21：从ECL底物转换至SuperSignal West Pico化学发光底物。

当条件经过优化后，SuperSignal™ West Pico化学发光底物比GE Healthcare ECL底物或Thermo Scientific™ Pierce™ ECL底物（货号32106）高2倍。

SuperSignal™ West Pico化学发光底物的检测下限为低皮克级（1 x 10^–12）。

Yes. However, SuperSignal Chemiluminescent Substrates were optimized for use in Western blots. For Southern and Northern blotting, use our North2South Chemiluminescent Nucleic Acid Hybridization and Detection Kit (Cat. No. 17097), North2South Chemiluminescent Substrate for HRP (Cat. No. 17295) or the Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Kit, if probing for biotinylated probes (Cat. No. 89880).

Western Blot信号增强剂应在将蛋白质转膜后，封闭或染膜前使用。

Western Blot信号增强剂可以松弛蛋白，以便抗体和蛋白能更有效的结合。

Western Blot信号增强剂可以对任何发光或显色底物起作用。

我们推荐在染膜和封闭前使用Western Blot信号增强剂。

剥离后的膜上仍有封闭试剂存留，所以你会得到不一致的结果。因此，我们建议仅在封闭和第一次膜杂交前使用Western Blot信号增强剂。

Western Blot信号增强剂不会和膜或蛋白质结合，因此不会干扰抗体和目的蛋白的结合。

Miser Antibody Extender Solution应在将蛋白质转膜后，封闭前使用。

Miser Antibody Extender Solution在硝酸纤维素膜上能提供一致的、可重复的结果；在PVDF膜上的结果因膜而异。

Miser Antibody Extender Solution应在使用丽春红染色后使用。

膜上的蛋白质更容易被抗体接触，使得使用较少抗体产生信号成为可能。

如果你对你的western信号满意，你可以使用Miser Extender Solution NC来减少你需要使用的抗体量，从而降低你的成本。如果你需要增加灵敏度，那么你可以使用Western Blot信号增强剂。

该检测利用HRP或AP偶联物与来自不同物种宿主的天然IgG结合，在免疫沉淀实验中获得清晰的特异性蛋白质免疫印迹检测结果，不受变性IgG的干扰。该试剂盒可作为二抗的替代品。

该试剂可与来自许多物种的IgG结合：牛IgG2，山羊IgG2，人IgG1、IgG2、IgG4，小鼠IgG2a、IgG2b、IgG3，大鼠IgG2c，绵羊IgG2，猪，狗和猫。该试剂不会与大鼠IgG2a和IgG2b或小鼠IgG1结合。如果怀疑该检测试剂会与某一抗体结合，可在正式实验前进行点印迹分析。

Clean-Blot™ IP检测可兼容牛血清白蛋白、SuperBlock™和StartingBlock™封闭缓冲液和5%脱脂牛奶。可通过点印迹分析对其他封闭缓冲液的兼容性进行验证。

为得到最佳结果，Clean-Blot™ IP检测可与SuperSignal™底物或Pierce™ ECL蛋白质免疫印迹底物一起使用。当使用其他HRP或AP底物时，可根据经验确定Clean-Blot™ IP检测试剂的最佳浓度。

可以。当使用化学发光底物时，可对膜进行剥离和再次检测，与使用二抗进行检测相似。

需要，iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒利用iBlot™系统（传统iBlot™干转系统或iBlot™ 2干转系统）产生电场，从而加速抗体和封闭剂与膜结合抗原间的相互作用。iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒需要具备P9程序（在2.9.5及更高版本的软件中可用）的iBlot™干转系统。如果您拥有传统iBlot™干转系统，则可在仪器登记页面免费下载程序。

我们可提供用于发光检测的iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒，可与抗鼠或抗兔二抗一起使用。该试剂盒含有蛋白质免疫印迹检测所需的试剂和检测膜组；您只需自行准备一抗。用于化学发光检测的iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒已停产。

iBlot™蛋白质免疫印迹检测膜组有两种尺寸：小型和普通型；它们带有检测分隔垫片，可使用1组以上抗体进行独立分析。使用小型尺寸时，您可在1张小型膜或2张1/2小型膜上进行检测。使用普通型尺寸时，您可在2张小型膜或4张1/4普通型膜（4 x 8 cm）上进行检测。

不可以。iBlot™蛋白质免疫检测膜组的离子量有限，运行一次即可耗尽，每次运行包括3个检测步骤：封闭、一抗和二抗。

不能。一套膜组是用于蛋白质免疫检测中所有3个步骤的。

不，不重要。iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒可兼容使用湿转法或半干转法获得的印迹膜。您可使用1张普通型膜（13.5 cm x 8 cm）或1-2张小型膜（8 x 8 cm）。

可以。iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒专门为此提供了可重复使用的分隔垫片。使用分隔垫片将膜分开，即可同时使用不同抗体溶液进行检测。用户使用手册中有详细方案。

使用iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒时，您可使用硝化纤维素膜或PVDF膜。但是，我们强烈建议使用硝化纤维素膜而不是PVDF膜，因为硝化纤维素膜的背景较低，可使检测更灵敏。

可以，只要在检测开始前将膜活化即可。应用水将硝化纤维素膜完全润湿。将PVDF膜浸泡在100%甲醇中几秒，直至膜完全湿润，然后用水润洗。最后，使用iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒进行检测。

用于iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒的底物将与碱性磷酸酶（AP）反应。因此，辣根过氧化物酶（HRP）底物对这类试剂盒无效。其他AP的结合物和底物也不能用于iBlot™蛋白质免疫印迹检测试剂盒。为获得最佳结果，该试剂盒中的试剂已经过优化。

天然抗体通常在中性pH下带有一些负电荷，从而使其在低电压下从载体基质电泳迁移到膜上。它们对抗原的亲和力将电场力抵消，因此，当游离抗体流过封闭膜并到达下层膜组上时，结合抗体被捕获。基本上，iBlot™系统的电泳主要在于抗体，从而大幅加速了抗体与固定抗原发生相互作用的速度。

如果您使用自己的荧光标记抗体，iBlot™蛋白质免疫印迹检测膜组可兼容LI-COR™检测。

不能。一抗溶液被用于基质后，不能再重复利用。

一抗浓度应为普通蛋白质免疫印迹检测中的2倍。应注意，iBlot™蛋白质免疫印迹检测系统所需的一抗溶液体积是传统方法的一半，所以一抗的总用量与传统方法是相同的。

在室温下，保质期为6个月。

在4℃下，保质期为12个月。

可以。为了将您的试剂用于新的膜组，您可单独购买膜组：iBlot™蛋白质免疫印迹检测膜组，普通型（货号IB701001）和iBlot™蛋白质免疫印迹检测膜组，小型（货号IB701002）。

WesternDot™试剂是畅销型二抗和精选型单克隆一抗的完整IgG（H+L）结合物，或红外或远红外荧光Qdot™探针、Qdot™ 585、Qdot™ 625、Qdot™ 655和Qdot™ 800的链霉亲和素结合物，可用于蛋白质免疫印迹分析。Qdot™探针的发射范围较窄且对称，与其他发光颜色的重叠极小，向相邻检测通道的渗透更少，因此可同时利用多种颜色。使用凝胶和印迹膜成像仪常用的任何紫外或蓝光光源，都能实现同等的最佳激发。此外，Qdot™探针的光稳定性极强，可多次成像，并且干燥的印迹膜可保存数月而荧光信号损失极小。

若想获得关于Qdot™技术的更多信息，请查看以下链接：

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/Qdot/technology-overview.html

http://www.lifetechnologies.com/us/en/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/Qdot/technology-overview.html

与ECL检测相比，WesternDot™试剂的灵敏度与其相近或稍高。灵敏度在皮克范围内。

利用WesternDot™二抗结合物检测皮克级的目标蛋白。利用凝胶转印设备（货号IB1001），将纯化AKT1重组人蛋白（货号P2999）的连续稀释液（2500 pg至5 pg）在NuPAGE™ Novex™ 4–12% Bis-Tris预制胶（货号IB3010-32）上电泳，并转印到硝化纤维素膜（货号IB3010-32）上。使用鼠抗AKT一抗（货号AHO1112）在膜上检测。可使用荧光WesternDot™ 625山羊抗鼠（货号W10808，上部）或利用辣根过氧化物酶连接山羊抗鼠IgG（下部）的ECL检测AKT1信号。利用Fujifilm™ LAS-4000凝胶成像仪对免疫印迹膜进行成像。利用Epi-UV透照仪和溴化乙锭滤镜对WesternDot™ 625印迹膜进行成像，利用化学发光检测设备对ECL印迹膜进行成像。

与基于酶反应的化学发光或显色检测法相比，WesternDot™ 检测具有很多优势：

• 可同时在同一张印迹膜上进行多重检测
• 对时间不敏感的简单方案，无需混合试剂
• 实验方案可靠，不会产生反应过度或不充分的印迹膜
• 光稳定性较高，干燥的印迹膜可归档保存
• 使用更常用的紫外或蓝光成像仪，而不是昂贵的化学发光成像仪或滤镜和化学品
• WesternDot™ 试剂与一抗的目标蛋白直接连接，可产生更清晰的条带，而不会出现酶检测方法产生的蛋白条带边缘扩散现象

可以，Qdot™ 625链霉亲和素结合物（货号Q22063，50 μL或货号A10196，200 µL）可以单独购买。

可以，它们的货号分别是B2763和B2770。

所有独立的WesternDot™试剂均可供25张小型凝胶印迹膜染色。WesternDot™625山羊抗鼠和山羊抗兔试剂盒（货号W10132和W10142）所含试剂可供20张小型凝胶印迹膜染色。

从收到之日起，WesternDot™检测试剂可在2-8℃下稳定保存至少6个月，我们不建议冷冻保存。

硝化纤维素膜和PVDF膜都可以使用。为获得更好的结果，我们建议使用硝化纤维素膜，从而将膜自体荧光产生的背景降至最低。

对于蛋白质免疫印迹，将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转印到硝化纤维素或PVDF膜上后，立即使用20 mL纯水洗膜2次，每次5分钟，从而除去部分凝胶和转移缓冲液成分以及弱结合蛋白质。随后，膜可立即用于WesternDot™免疫检测实验方案。

或者，将洗过的膜放在一张干净的滤纸上，在微热气流或红外灯下蒸干。适当干燥的膜可在4℃的密封容器内保存7天，保存时间取决于抗原。经水洗和干燥的硝化纤维素膜可立即用于WesternDot™免疫检测实验方案。但是，经水洗和干燥的PVDF膜需要在甲醇中再润湿，随后用20 mL水洗涤2次，每次5分钟，最后用于WesternDot™免疫检测实验方案。

对于非变性PAGE蛋白质免疫印迹膜，建议在所有洗涤步骤前实施干燥步骤，改善蛋白质与膜的结合。干燥后，应使用20 mL水将硝化纤维素膜洗涤2次，每次5分钟，然后再用于WesternDot™免疫检测实验方案。干燥的PVDF膜需要在甲醇中再润湿，随后用20 mL水洗涤2次，每次5分钟，最后用于WesternDot™免疫检测实验方案。

任何一种缓冲液配方都不能完全适用于所有蛋白质/抗体。含2%酪蛋白、5%脱脂干奶粉或1/2X鱼血清（如SEA BLOCK）的1x PBS/TBS溶液适用于大多数目标蛋白和抗体组合。不要使用含BSA的溶液封闭或孵育WesternDot™结合物，否则可能导致高背景和/或信号降低。对于不兼容酪蛋白或牛奶的一抗（如，许多抗磷蛋白抗体），应使用鱼血清或含0.5%BSA的溶液。如果使用BSA，则仅能用于一抗孵育；在所有其他步骤中，应使用2%酪蛋白、5%脱脂奶粉或1/2X鱼血清。

不同的一抗具有不同的理想工作浓度。为获得最佳结果，应参考抗体供应商的建议条件，或在使用前对一抗的工作浓度进行优化。

WesternDot™二抗结合物的建议稀释倍数为1:500。使用该浓度，每管WesternDot™二抗结合物可供25张免疫印迹膜使用。

为获得最佳结果，应参考供应商的建议孵育时间，或对孵育时间进行优化。一般来说，一抗可在室温下孵育1小时，或在4℃孵育过夜。对于WesternDot™二抗结合物，我们建议在室温下孵育1小时。

Tween™ 20 is a detergent commonly used in western blot buffer formulations. For WesternDot™ secondary conjugates, we found the use of Tween™ 20 in buffers to be suitable for nitrocellulose membrane blots, but not necessary for desirable results. Because Tween™ 20 leads to high background on PVDF membrane it is not recommended for use with WesternDot™ secondary conjugates in combination with PVDF. If PVDF membranes are used, Tween™ 20 should be omitted from all the buffer formulations.

不需要。Qdot™探针在正常室内光照条件下很稳定，因此，印迹膜孵育和干燥无需避光。

不能，WesternDot™染色液应在配制后立即使用，并且只能使用一次。Qdot™探针稀释到缓冲液中后，不能长期保持稳定。

多重蛋白检测过程与单一蛋白检测相同。将蛋白质转印到PVDF膜或硝化纤维素膜上并封闭后，使用各目标蛋白的一抗混合液孵育印迹膜，然后使用各一抗的WesternDot™二抗结合物混合物进行检测。例如，对Akt、磷酸化Akt和GAPDH进行三色多重检测，则使用兔抗Akt抗体、鼠抗磷酸化Akt和鸡抗GAPDH抗体的混合液孵育印迹膜，然后使用WesternDot™ 605山羊抗兔IgG、WesternDot™ 655山羊抗鸡完整IgG和WesternDot™ 800山羊抗鼠IgG的混合物进行检测。

一张免疫印迹膜含有未经刺激（泳道2-5）和经hEGF刺激（泳道6-9）的A431细胞裂解物的连续稀释物（20–3 μg蛋白质），使用鼠抗EGFR、兔抗磷酸化EGFR和鸡抗GAPDH抗体进行孵育，然后使用WesternDot™ 800山羊抗鼠（蓝色）、WesternDot™ 585山羊抗兔（红色）和WesternDot™ 655山羊抗鸡（绿色）结合物进行检测。在融合图像中，蓝色和红色条带重叠后显示为紫色。印迹膜含有MagicMark™ XP免疫印迹蛋白质标准品（泳道1，货号LC5603），并使用Fujifilm™ LAS-4000凝胶成像仪进行成像。

可以，可使用试剂将印迹膜剥离并再次检测。一般来说，WesternDot™结合物比标准品染料或蛋白标记的二抗结合物更易去除，一抗最难去除。您应使用能够去除一抗的剥离液。我们利用Restore™和Restore™ Plus剥离液并按照它们的操作步骤在室温下进行剥离，获得了良好的结果。在50℃加热，可完全去除一抗。WesternDot™试剂具有多重检测能力，使用合适的可兼容性一抗和WesternDot™试剂，即可对多种蛋白同时进行检测，因此，不再需要剥离和再次检测。

可以，使用WesternDot™试剂和WesternBreeze™ CDP-Star™、WesternBreeze™ BCIP/NBT和ECL试剂可进行多重检测。WesternBreeze™ CDP-Star™是该应用的首选检测试剂。依次在一抗和二抗溶液中共同孵育，然后进行WesternDot™检测。WesternDot™成像使用的紫外激发和发射光滤镜无法检测到CDP-Star™化学发光信号，因此，在CDP-Star™底物孵育前或者之后在湿润或干燥的印迹膜上均可对WesternDot™信号进行成像。WesternBreeze™ BCIP/NBT和ECL信号可在WesternDot™成像中被检测到，因此，在加入这些检测试剂前，必须在湿印迹膜上首先对WesternDot™信号进行成像。

可以，蛋白质免疫印迹处理设备适用于WesternDot™试剂。

任何带有紫外或蓝光激发器以及溴化乙锭滤镜的基础凝胶或印迹膜成像仪，都可用于WesternDot™ 625结合物的单色检测。带有紫外或蓝光底座或橙色滤镜的E-Gel™成像仪，可用于对WesternDot™ 585或WesternDot™ 625结合物染色的印迹膜进行单色检测。对于双色或三色多重检测，GE Healthcare ImageQuant™ LAS 4000含有适用于WesternDot™585、625、655和800结合物成像的滤镜套装。关于所有WesternDot™试剂的其他特殊成像仪和滤镜组合，请参见Western Dot™二抗结合物使用手册中的表2。

WesternDot™试剂具有光稳定性，因此可进行多次成像而无信号强度损伤。

WesternDot™ 655山羊抗鼠二抗结合物标记的MagicMark™蛋白质标准品（货号LC5602）；左图为第1次成像，右图为第10次成像。

WesternDot™试剂具有光稳定性，因此，干印迹膜可长期保存而无信号强度损失。

用于检测β-tubulin的硝化纤维素膜，使用WesternDot™ 655山羊抗鼠试剂进行检测；左图为初次成像结果，右图为常温保存3个月后的成像结果，无信号损失。

不需要，湿润或干燥的印迹膜均可用于成像。为维持信号的长期稳定，印迹膜应保持干燥状态。

使用紫外范围激发可产生最亮的信号和最低的灵敏度，但是，也可使用带有蓝光光源（如，450 nm或473/488 nm）的成像仪。

经WesternDot™结合物染色的印迹膜成像时，应将蛋白质一面朝向光源。所以，在紫外透照仪上，印迹膜应正面朝下。

不能，Li-COR™Odyssey成像仪的激发波长为685 nm和785 nm。为获得最佳灵敏度，您需要使用带有紫外或蓝光激发器的仪器。WesternDot™试剂在它们的发射峰附近激发较弱，所以，您可能会看到一些信号，但灵敏性远远低于远红外荧光染料。

不建议这样做，因为，用于制备WesternDot™结合物的Qdot™探针显著大于IgG。Qdot™探针约为1.5X106 — 2X106 Da（与IgM大小相近），因此，在凝胶基质中的渗透率远远低于无标记的抗体或者HRP或碱性磷酸酶标记的抗体。该试剂可能可以用于经过一些优化的比例非常低的丙烯酰胺凝胶，但是灵敏性会低于印迹膜。

与ECL检测相比，WesternDot™检测试剂和远红外染料的灵敏度与其相近或更好。两种试剂均使用相似的染色方案，并且在干燥的印迹膜上可被归档保存。同时，WesternDot™试剂和远红外染料都是直接与一抗目标蛋白连接，因此，染色蛋白条带的分辨率非常清晰，而不会出现基于酶/底物的化学发光和发光检测法产生的蛋白条带边缘扩散现象。与远红外荧光染料相比，WesternDot™试剂的优势是紫外-蓝光激发波长与发射波长非常远，因此，实际上不存在来自于印迹膜或封闭蛋白的自体荧光背景，可获得良好的信噪比和对比度非常高的图像。远红外荧光染料的激发波长与发射波长很近，所以，会产生一些来自于印迹膜或封闭蛋白的自体荧光背景。WesternDot™检测试剂的光稳定性比荧光染料更强，染色或操作过程无需避光。WesternDot™检测试剂只需大多数凝胶和印迹膜成像仪常用的紫外或蓝光激发光源，无需购买特殊的成像仪。WesternDot™ 625试剂与溴化乙锭染色凝胶使用相同的激发光源和发射光滤镜。

可能可以，但尚未被验证。应使用我们的任意一种链霉亲和素标记的Qdot™探针（如，我们的Qdot™ 625链霉亲和素结合物，货号Q22063），利用Northern或Southern印迹杂交实验，对生物素化探针进行检测。

Alexa Fluor™ 680和790结合型二抗的检测灵敏度与相同浓度的Li-COR™ IRDye 680和800染料相当。

Alexa Fluo™ 680和790二抗试剂的灵敏性与ECL化学发光检测相近。灵敏度在皮克范围内。与基于酶反应的化学发光或发光检测法相比，远红外荧光检测具有很多优势：

• 可同时在同一张印迹膜上进行多重检测
• 方案简单，对时间不敏感，无需混合试剂
• 实验方案可靠，不会产生反应过度或不充分的印迹膜
• 光稳定性较高，干燥的印迹膜可归档保存
• 使用更常用的紫外或蓝光成像仪，而不是昂贵的化学发光成像仪或滤镜和化学品
• 远红外二抗结合物与一抗的目标蛋白直接连接，可产生更清晰的条带，而不会出现酶检测方法产生的蛋白条带边缘扩散现象

技术上，非远红外Alexa Fluor™抗体可用于蛋白质免疫印迹，但是灵敏度比其他检测方法差，所以不推荐使用。印迹膜，特别是PVDF，具有较高的荧光背景，蓝/绿范围内的荧光最强，这会增强噪音并降低灵敏性。封闭蛋白也可能是具有自体荧光的，会增加背景。远红外范围内的印迹膜荧光背景非常低，所以Alexa Fluor™ 680和790染料具有较高的灵敏度。非远红外Alexa Fluor™染料不能制备良好的免疫印迹检测试剂的第二个原因是，非Alexa Fluor™ 680和790抗体结合物经过优化，可产生较高的免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）信号，并且通常具有较高的染料：抗体标记比例，导致染料与印迹蛋白和膜之间发生大量的非特异性电荷结合，从而增强染色背景并降低信噪比。

Alexa Fluor™ 680和790二抗结合物具有不同程度的标记，专为免疫印迹检测而优化，因此，它们的结合效率可产生较高的信号和较低的非特异性结合。

可以，蛋白质免疫印迹处理设备适用于Alexa Fluor™ 680和790标记的二抗，其灵敏性与手动处理相近或比手动处理更好。参见该链接中的图2。

良好的起始工作浓度约为0.5 µg/mL，即2 mg/mL储液按1:4000稀释。最佳浓度范围0.1–1 µg/mL，具体浓度取决于目标蛋白的丰度。

所有Alexa Fluor™ 680和790二抗结合物的供应规格均为0.5 mL 的2 mg/mL储液或1 mg粉末。当工作浓度为5 µg/mL时，可供200张印迹膜染色，每张膜10 mL。

从收到之日起，WesternDot™检测试剂可在2-8℃下稳定保存至少6个月，我们不建议冷冻保存。

硝化纤维素和PVDF膜均可使用。为获得更好的结果，我们建议使用硝化纤维素膜，从而将膜自体荧光产生的背景降至最低。

可以，经Alexa Fluor™ 680和790染色的印迹膜在湿润或干燥状态下均可成像。为了长期保存，我们建议将膜干燥。

微孔板经过封闭处理后，去除封闭缓冲液并风干数小时。将微孔板与干燥剂一起装在塑料袋中，保存于4℃。为实现最佳的保存，应在24小时后更换干燥剂。微孔板可稳定保存至少12个月。

不含。除非是名字中含有“T20”的封闭缓冲液，如SuperBlock T20（PBS）封闭缓冲液，含有0.05% Tween 20

不需要。该产品以1X浓度供应，应“按原液”使用。

常规程序是在室温孵育1小时或在4℃孵育过夜。但是，在很多程序中，在室温下孵育3 x 2分钟足以实现有效封闭。

在4℃下的有效期为1年。

卡松防腐剂，一种广谱抗微生物剂，浓度为600 ppm。

将所有存在的胶态碳沉至瓶底，然后将您需要使用的溶液倒出。我们不建议离心或过滤，因为这些操作可能会使产品的封闭能力降低。

有两种剥离缓冲液，每种都具有2种不同规格：

• Restore Western Blot剥离剥离缓冲液：货号21059（500 mL），货号21063（5 L）和货号21062（30 mL）
• Restore Plus Western Blot剥离剥离缓冲液：货号46430（500 mL），货号46428（30 mL）

Restore Western Blot剥离缓冲液可温和而有效得从膜上剥离一抗和二抗，从而对同一张膜进行再次检测。该缓冲液配方可有效用于多种相互作用，但是，有些高亲和性抗原-抗体相互作用需要更强力的剥离条件。Restore Plus Western Blot剥离缓冲液专为难剥离的相互作用而开发。

未进行测试。每种结合相互作用的模式（即，实际发生相互作用的氨基酸或功能性基团）和亲和性（在给定缓冲液条件下的结合强度）都稍有不同。首先，尝试使用Restore Western Blot剥离缓冲液在室温下剥离15分钟。如果未完全去除抗体，则通过延长时间和升高温度对剥离条件进行优化。如果仍未完全剥离抗体，则改为使用更强力的Restore Plus Western Blot剥离缓冲液。

需要。为获得最佳结果，孵育时间和温度都必须优化。

可以。剥离缓冲液是用于从抗原上分离抗体的，因此，结合抗原的膜通常不会影响剥离。

使用Restore缓冲液剥离后的膜，通常无需再次封闭，但是再次封闭在某些情况下可能有助于降低背景。相反，使用Restore Plus缓冲液剥离后的膜需要再次封闭。

不能。抗体可以被去除，但底物会永久沉淀在膜上，不能被去除。Restore和Restore Plus缓冲液专为利用化学发光底物的实验过程而设计。

不能。Restore和Restore Plus缓冲液的剥离力度不足以破坏抗生物素蛋白-生物素相互作用。能够破坏这一相互作用的缓冲液也可能会损害目标蛋白，使其无法被检测到。

不能。尽管荧光抗体，如其他抗体，可被Restore缓冲液剥离，但被剥离的膜在后续荧光检测中通常会产生较高的背景。我们建议使用Restore Fluorescent Western Blot剥离缓冲液，货号62299（20 mL）和货号62300（100 mL）。

注意：Restore Fluorescent Western Blot剥离缓冲液仅能用于低荧光PVDF膜（货号22860）。

洗膜缓冲液应与蛋白质免疫印迹中抗体检测步骤之间所用的缓冲液相同。

粘附（转印和结合的）蛋白的稳定性决定了膜在剥离后可成功再次检测的次数。蛋白质可承受剥离的次数最多4次、最少1次。

是的，BenchPro™ 4100卡片处理站于2014年12月31日起停产。之前购买的所有仪器将享受生产商的一年保修。为支持已购买仪器的客户，在2017年12月31前，我们继续生产和销售BenchPro™ 4100的耗材。

用湿布清理BenchPro™ 4100卡片处理站的表面。不要使用刺激性去污剂或溶剂清洁设备。每次使用后，用水冲洗试剂托盘组件和废水池。如果瓶子和管子是可重复使用的，则用温和去污剂清洗，并用超纯水彻底冲洗。不要将托盘或试剂瓶和试管进行高压灭菌。尽管所有试剂瓶和试管在使用温和去污剂清洗并用去离子水冲洗后均能重复使用，但是我们不推荐重复使用25 mL试管，以防止任何试剂发生交叉污染。

25 mL试管可单独购买，规格为50管/包（货号WP3001）。但是，我们不提供试剂瓶的独立产品。您可从Cole Parmer公司购买。

250 mL试剂瓶（套装1）（货号EW-06019-76） (http://www.coleparmer.com/Product/Bottles_Squre_HDPE_250ml_10_pk/EW-06019-76

125 mL试剂瓶（套装2）（货号EW-06254-20）(http://www.coleparmer.com/Product/Thermo_Scientific_Nalgene_Sterile_PETG_Media_Bottles_125_mL_48_box/EW-06254-20)

我们不提供自动排水用6 ft排水管。它的规格为¼” OD x 1/8” ID，您可登录网站http://www.mcmaster.com/#catalog/119/136/=q5ikda进行购买。

BenchPro™ 4100卡片处理站采用3种最常用的免疫印迹分析方案进行预先编程：2种用于Western Breeze™免疫检测，1种用于标准ECL检测。这些方案经过编程，可将一抗送还到原试管中。此外，超过17个自定义方案可被保存在系统记忆中。对自定义方案进行编程，可根据需要将任何试剂送还到原容器中。

该仪器可处理1-4张Western卡片。每张卡片可同时处理1或2张膜，背对背放置。因此，该系统每次运行可同时处理最多8张膜。

可以，因为每张卡片分开处理。

8.5 cm x 8.5 cm是可处理的最大膜尺寸。

无需同时使用4张卡片。您可使用1张卡片或同时使用2-4张卡片。

不能，该卡片不可重复使用。仪器能够检测出使用过的卡片，卡片右下角的颜色指示点会在卡片被使用后变成红色。

操作温度范围为4-40℃。所以，可根据需要，在冷室或保温箱中操作仪器。但是，我们在冷室中只测试过几天。

可以，处理器经过编程，可将使用过的试剂返还到原试管中。

我们尚无任何经过验证的方案，但是我们建议用箔纸覆盖Western卡片或尽可能在暗室中运行实验。

不需要，但是请确保将试剂瓶和试管装载到与将被使用的卡片位于同一排的托盘中。设备可自动检测到哪个插槽含卡片，只有含卡片的插槽在运行期间是可发挥功能的。

BenchPro™ 4100卡片处理站的保修期为交货之日起一（1）年。自2014年12月31日设备停产起，三年延保（货号A12463）不可继续购买。

保险丝为250 V、1.25 A。我们不提供保险丝独立产品，但可从电子产品供应商处购买，如RadioShack。

快速程序的检测灵敏度通常可达到标准WesternBreeze™免疫检测方案的70–80%。

运行后，每种缓冲液约有0.5–1 mL将保留在卡片和吸管中。

很遗憾，系统中止后，不会将试剂送回至原试管中；它们将随机排出卡片。

BenchPro™ 4100可通过将一抗孵育步骤的时间延长至几百分钟来实现过夜孵育。其他试剂应从一开始就要装载到仪器中，因为无法在第二天停止运行、取出卡片装入新试剂，然后使用前一天使用的卡片继续执行相同方案。如果担心试剂在室温中过夜会出现问题，可在冷室或Deli冷却器中运行仪器。

从功能上来说，母步骤和子步骤的执行是相同的。但是，您需要在编辑一个母步骤后才能编辑子步骤（否则会显示错误信息）。如果您选择“母步骤”，然后立即选择“子步骤”，则“母步骤”会默认为1分钟，但不会保存“时间”，保存的方案将显示为进入“母步骤”。当浏览保存后的实验方案时，会看到上述情况。