免疫印迹检测支持 - 疑难解答 | Thermo Fisher Scientific

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概述

我使用你们的一种凝胶进行蛋白质样品电泳，免疫印迹检测后得到条带模糊不清。我该怎么办？

以下是一些建议：

应确保每个泳道的蛋白上样量均正确——蛋白上样过多可导致条带模糊。
低比例凝胶不能良好分离条带——尝试使用更高比例的凝胶。
这可能是由于抗体浓度过高。我们建议遵循生产商的建议进行稀释或确定最佳抗体浓度。

免疫印迹检测后，我的蛋白质条带无法显色为什么？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
一抗和二抗不匹配	所用二抗应该是针对一抗物种来源的抗体。
一抗稀释过度	1) 使用浓度更高的抗体溶液。2) 在4℃孵育更长时间（如，过夜）。3) 使用新鲜的抗体，应注意抗体溶液每使用一次，其有效抗体浓度都会有所降低。
封闭液含有可干扰一抗和/或二抗结合的物质	尝试交替使用封闭液± 温和的表面活性剂，如Tween™-20（0.01–0.05% v/v）。基于脱脂奶粉、BSA、普通血清、明胶和这些物质的混合物以及其他原料，有多种封闭液配方可用。应注意BSA（1–5%）被认为是硝化纤维素膜的最佳封闭剂。通过点印迹法可轻松检验不同封闭液的效能。
一抗不能识别测试物种的相关蛋白质	1) 首先通过点印迹法评估一抗与蛋白质的反应能力。2)检查免疫原序列（如果已提供），确定您的蛋白质中是否含有该序列。3)如果无可用的免疫原序列，则通过PubMed/BLAST比对来评估您的目标蛋白与抗体的目标蛋白之间的同源程度。应注意，许多抗人源蛋白的抗体，也可识别非人源的灵长类动物蛋白，因为人源蛋白与灵长类动物蛋白具有高度的氨基酸同源性。相比之下，许多抗人源蛋白的抗体却不能识别啮齿类动物的相应蛋白（反之亦然）。应记住（注意），序列间显著的同源性并不能保证抗体可识别您的蛋白质。4)尽量每次电泳都使用推荐的阳性对照。
与膜结合的蛋白质不足，或样品中的目标蛋白不足	1) 凝胶上每个泳道中的蛋白质上样量至少为20–30 μg（作为起始点），因为，含量低于总蛋白量约0.2%的蛋白质，难以在免疫印迹中被检测到。2) 采用富集步骤以增加目标蛋白的浓度。例如，在转印核蛋白前制备2份细胞核裂解物，或在SDS-PAGE前进行免疫沉淀（IP）。3)减少用于裂解细胞或组织的细胞提取缓冲液的体积。4) 如果需要，应确保蛋白质提取缓冲液中使用新鲜配制的蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂。5)尽量使用推荐的阳性对照进行电泳。
很少或没有蛋白质转印到膜上	1) 使用可逆性蛋白质染料（如，Novex™可逆性膜蛋白质染料、丽春红S、酰胺黑）或预染分子量标准品，检验蛋白质转印效率。2) 确认是否使用了正确的电源极性进行转印。3)应记住，碱性pl值的蛋白质（如，组蛋白）和高分子量蛋白质的转印效果较差。4) 应记住，如果您的目标蛋白分子量较低（≤10 kDa），则转印速度可能比预期更快。5)如果您使用的是PVDF膜，应先将膜在甲醇中预浸泡，然后再浸泡在转膜液中。应注意，转膜液中的甲醇可增加膜与硝化纤维素膜的结合，但减少甲醇可增强高分子量蛋白质的转印效率。6) 低分子量蛋白质可能会穿过孔径为0.45 μm的硝化纤维素膜，因此，应改为使用0.2或0.1μm孔径的NC膜。
洗膜或封闭过度	1) 避免过度洗膜。若您的印迹存在其他问题，过度洗膜将导致目标蛋白无法显色。2) 避免由高浓度封闭液成分或较长孵育时间造成的过度封闭。封闭过度可妨碍抗体与蛋白的结合。明胶特别容易遮盖印迹膜上的蛋白质，因此应尽量避免使用。牛奶也会遮盖蛋白质，因此，可尝试使用0.5%牛奶或完全去除牛奶来取代封闭液中的5%牛奶。3)改为使用不同的封闭剂和/或缩短封闭时间。
重复使用相同的一抗稀释液	每次免疫印迹都应使用新鲜稀释的抗体，因为每重复使用一次稀释后的抗体，其有效浓度都会有所降低。同时，应记住抗体稀释液的稳定性降低，可能会很快失去活性。
与二抗结合的酶失效	1) 每次都使用新鲜稀释的二抗结合物。稀释液中的酶（和抗体）可能会很快失活。2) 若您使用的是辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体，则不要在缓冲液中加入叠氮化钠。3)避免高血红素浓度（来自血液污染），否则会干扰基于HRP的检测。4) 避免在含有碱性磷酸酶-抗体结合物的缓冲液中加入磷酸盐，因为磷酸盐会抑制酶活性。
您的比色检测或其他检测试剂太旧并且已失活	1) 每次试验均使用新鲜的酶底物。2) 不要使用颜色发生改变或超过有效期的即用型底物试剂。3)除非产品使用手册指示，否则不要稀释底物溶液。

我使用你们的MagicMark™ XP Western蛋白标准品进行免疫印迹检测后，得到的信号非常微弱或几乎没有信号。你们能否帮我排除故障[排查原因]？

以下是一些建议：

应确认检测试剂有效。优化抗体浓度以获得最佳结果。
应确保标准品在凝胶上的上样量是正确的。
优化转印条件（电流、电压和转印时间）。
酶标记一抗可能未与MagicMark™ XP Western蛋白标准品中的蛋白质有效结合。我们建议使用无标记的一抗，并随后使用酶标记的二抗。

注意：Anti-myc-AP/HRP和Anti-V5-AP/HRP抗体不能与MagicMark™ XP蛋白结合。

免疫印迹检测后，我得到了非常高的背景。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
封闭不充分或发生非特异性结合	建议尝试使用我们的WesternBreeze™封闭剂/稀释液（货号WB7050）。
膜污染	仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
PVDF膜本身具有较高的背景	改为使用硝化纤维素膜。
硝化纤维素膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
印迹膜显色过度	遵循推荐的显色时间，当达到可接受的信噪比时，从底物中取出印迹膜。
洗膜不充分	遵循推荐的洗膜次数。在一些情况下，可能有必要增加洗膜次数和时间。
二抗浓度较高	通过点印迹法确定最佳抗体浓度，必要时可稀释抗体。
一抗浓度较高	通过点印迹法确定最佳抗体浓度，必要时可稀释抗体。

免疫印迹检测后，我得到了很多非特异性结合。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
二抗浓度较高	按照推荐方法稀释二抗。如果背景仍然很高，但条带强度也很高，则应降低二抗的浓度。
一抗浓度较高	降低一抗浓度。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。
SDS残留或转印后蛋白质与膜的结合较弱	遵循免疫检测前的膜准备说明。
封闭时间过短或洗膜时间过长	应确保每一步都达到指定时间。

免疫印迹检测后，我的膜上有很多点。哪里出错了？

以下是可能原因和解决方案：

膜的转印垫不干净或污染。使用转印垫前，用去污剂浸泡，然后用纯水彻底清洗。转印垫破损或变色后，则更换新的转印垫。
封闭不均匀。孵育皿必须足够大，使封闭液能够完全覆盖膜。每一步都需要摇动或搅动。

我该如何降低PVDF免疫印迹膜的背景？

PVDF膜需要更为严格的封闭步骤。这可通过将封闭剂的浓度增加2-5倍、延长封闭时间并在37℃封闭来实现。封闭剂与无蛋白质结合的位置结合，可防止背景染色，并封闭与膜结合的蛋白质，以减少其与一抗发生非特异性相互作。封闭剂可使用脱脂奶粉、BSA和酪蛋白。

iBind™蛋白质免疫印迹处理系统

我使用iBind™蛋白质免疫印迹处理系统时，得到了较高的背景。我该怎么办？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。孵育皿应足够小，使封闭液能够完全覆盖膜，防止膜干燥。注意：如果使用的是PVDF膜，我们建议确保使用甲醇活化，特别是干燥的膜。刚刚结束转印并转移到1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液中的PVDF膜无需活化。
膜污染	仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
膜过度曝光或在曝光过程中变湿	缩短曝光时间或使信号进一步衰减。将膜放在透明薄膜中防止泄漏，并在曝光前从边缘吸去过量的底物。
溶液或孵育托盘污染	使用干净的玻璃器皿和纯水制备溶液。使用新的托盘或使用玻璃器皿专用去污剂彻底清洗托盘。用纯水彻底清洗。始终佩戴干净的手套。
一抗浓度较高	按照使用手册的说明稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。
对PVDF膜使用了错误的化学发光底物	应确保使用无增强剂的CDP-Star™试剂。
印迹膜显色过度	遵循推荐的显色时间，当达到可接受的信噪比时，从底物中取出印迹膜。
使用墨水标记膜	使用墨水对膜进行标记，仅限于印迹膜的低分子量区域。
iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1XiBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液。
向iBind™孔中加入溶液时出错	根据使用手册第18页的说明，按正确顺序向每孔中加入合适的溶液。
印迹膜在iBind™卡片上的位置不当	-将膜置于iBind™卡片上的指定膜区域。-印迹膜上有蛋白质的一面应与iBind™卡片接触。-低分子量区域应与膜组最近。-膜不应该与膜组接触。

以下是关于降低背景的一些其他技巧：

如果使用iBlot™ PVDF膜组，应确认其尚未超过有效期，因为背景会随时间升高。使用iBlot™ 2 PVDF膜组将有助于降低背景。
应确保在加入底物前将印迹膜置于蒸馏水中清洗。不要在PBS或TBS中清洗。

使用iBind™蛋白质免疫印迹处理系统时，我得到了很多非特异性结合。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
一抗浓度较高	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。
SDS残留或转印后蛋白质与膜的结合较弱	根据使用手册的指示，遵循免疫检测前的膜准备说明[在免疫检测前，遵循说明来准备膜。]。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。
iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液。

我使用iBind™蛋白质免疫印迹处理系统时，得到的信号非常微弱或几乎没有信号。问题出在哪里？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	重复转印。转印后，对膜进行染色以衡量转印效率。使用阳性对照和/或分子量标记物。
膜未完全湿润。	遵循预润湿膜的说明。
一抗浓度过低	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。
一抗失活	通过点印迹法确定抗体活性。
一抗与抗原的亲和力较低	获取更高亲和力的一抗。
二抗溶液污染	始终佩戴手套，瓶子在未使用时始终保持拧紧状态。制备试剂时，只使用纯水。
目标蛋白跑出凝胶	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。
蛋白质保留较差	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。使用具有相关大小蛋白质的分子量标记物。较大的蛋白质需要较长的转印时间，较小的蛋白质所需转印时间较短。使用具有适当结合能力的膜。
iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液。
向iBind™孔中加入溶液时出错	应确保将溶液加到正确的孔中，并按正确顺序向孔中加液。
印迹膜在iBind™卡片上的位置不当	应确保印迹膜上有蛋白质的一面与iBind™卡片接触，并放置在标有“膜”的区域。
膜组在运行前是湿的	应确保将5 mL 1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液加到iBind™卡片的平坦区。不要将溶液加到膜组上。
不同孔中的溶液发生交叉污染	运行期间，不要移动iBind™蛋白印迹处理仪。
iBind™卡片损坏	更换新卡片。应确保膜在卡片上的移动仅限于标有“膜”的区域内。
膜与iBind™卡片接触不良	加入1 mL 1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液后，立即将膜放到iBind™卡片上。使用附带的滚轮，确保接触良好。
在运行结束前打开设备	卡片在设备中时，不要打开设备。重新密封卡片上的孔，可导致泄漏。
样品制备不当；抗原性减弱或损毁	SDS和还原剂可能干扰一些抗体/抗原亲和力
样品太稀	提高蛋白质样品的浓度，或增加上样量。
蛋白质与膜的结合较弱	转膜液应含10–20%甲醇。
曝光时间不足	对膜进行二次曝光，并延长曝光时间。
底物孵育不充分	应确保每一步都达到指定时间，或在达到可接受的信噪比时，从底物中取出印迹膜。
底物污染	始终佩戴手套，瓶子在未使用时始终保持拧紧状态。制备试剂时，只使用纯水。
印迹太旧	蛋白质会随时间降解。应使用新制备的印迹。

我使用iBind™蛋白质免疫印迹处理系统时，得到了一个较大的分散信号。可能原因是什么？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
蛋白质上样量过高	减少上样量或稀释样品浓度。
转印效果差或转印不完全	重复转印。
一抗浓度过高	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。

最近使用iBind™蛋白质免疫印迹处理系统时，运行时间超过3小时。问题出在哪里？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
iBind™卡片损坏	更换新卡片。应确保膜在卡片上的移动仅限于标有“膜”的区域内。
膜组在运行前是湿的	应确保将5 mL 1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液加到iBind™卡片的平坦区。不要将溶液加到膜组上。
iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液。

我使用了iBind™蛋白质免疫印迹处理系统，结果膜上有很多点。可能原因是什么？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	重复转印。
膜的转印垫不干净或污染。	使用转印垫前，用去污剂浸泡，然后用纯水彻底清洗。转印垫破损或变色后，则更换新的转印垫。
膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
封闭不均匀	孵育皿应足够小，使封闭液能够完全覆盖膜。
使用墨水标记膜	使用墨水对膜进行标记，仅限于印迹膜的低分子量区域。
iBind™卡片损坏	更换新卡片。应确保膜在卡片上的移动仅限于膜区域内。
膜与iBind™卡片接触不良	加入1 mL 1X iBind™溶液/iBind™荧光检测（FD）溶液后，立即将膜放到iBind™卡片上。使用附带的滚轮，确保接触良好。

iBind™ Flex蛋白质免疫印迹处理系统

我使用iBind™ Flex蛋白质免疫印迹处理系统时，得到了较高的背景。我该怎么办？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。孵育皿应足够小，使封闭液能够完全覆盖膜，防止膜干燥。注意：如果使用的是PVDF膜，我们建议确保使用甲醇活化，特别是干燥的膜。刚刚结束转印并转移到1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液中的PVDF膜无需活化。
膜污染	仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
膜过度曝光或在曝光过程中变湿	缩短曝光时间或使信号进一步衰减。将膜放在透明薄膜中防止泄漏，并在曝光前从边缘吸去过量的底物。
溶液或孵育托盘污染	使用干净的玻璃器皿和纯水制备溶液。使用新的托盘或使用玻璃器皿专用去污剂彻底清洗托盘。用纯水彻底清洗。始终佩戴干净的手套。
一抗浓度较高	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。
对PVDF膜使用了错误的化学发光底物	应确保使用无增强剂的CDP-Star™试剂。
印迹膜显色过度	遵循推荐的显色时间，当达到可接受的信噪比时，从底物中取出印迹膜。
使用墨水标记膜	使用墨水对膜进行标记，仅限于印迹膜的低分子量区域。
iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液。
向iBind™ Flex孔中加入溶液时出错	根据使用手册的说明，按正确顺序向每孔中加入合适的溶液。
印迹膜在iBind™ Flex卡片上的位置不当	-将膜置于iBind™ Flex卡片上的指定膜区域。-印迹膜有蛋白质的一面应与iBind™ Flex卡片接触。-低分子量区域应与膜组最近。-膜不应该与膜组接触。
卡片膜组在运行前是湿的	应确保将10 mL 1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液加到卡片的流动区域。不要将溶液加到膜组上。

以下是关于降低背景的一些其他技巧：

如果使用iBlot™ PVDF膜组，应确认其尚未超过有效期，因为背景会随时间升高。使用iBlot™ 2 PVDF膜组将有助于降低背景。
应确保在加入底物前将印迹膜置于蒸馏水中清洗。不要在PBS或TBS中清洗。

使用iBind™Flex蛋白质免疫印迹处理系统时，我得到了很多非特异性结合。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
一抗浓度过高	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。
SDS残留或转印后蛋白质与膜的结合较弱	根据使用手册的指示，遵循免疫检测前的膜准备说明。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。
iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液。

我使用iBind™Flex蛋白质免疫印迹处理系统时，得到的信号非常微弱或几乎没有信号。问题出在哪里？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	重复转印。转印后，对膜进行染色以衡量转印效率。使用阳性对照和/或分子量标记物。
膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
一抗浓度过低	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。
一抗失活	通过点印迹法确定抗体活性。
一抗与抗原的亲和力较低	获取更高亲和力的一抗。
二抗溶液无染	始终佩戴手套，瓶子在未使用时始终保持拧紧状态。制备试剂时，只使用纯水。
目标蛋白跑出凝胶	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。
蛋白质保留较差	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。使用具有相关大小蛋白质的分子量标记物。较大的蛋白质需要较长的转印时间，较小的蛋白质所需转印时间较短。使用具有适当结合能力的膜。
iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液。
向iBind™ Flex孔中加入溶液时出错	应确保将溶液加到正确的孔中，并按正确顺序向孔中加液。
印迹膜在iBind™ Flex卡片上的位置不当	应确保印迹膜上有蛋白质的一面与iBind™ Flex卡片接触，并放置在标有“膜”的区域。
膜组在运行前是湿的	应确保将5 mL 1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液加到iBind™ Flex卡片的平坦区。不要将溶液加到膜组上。
不同孔中的溶液发生交叉污染	运行期间，不要移动iBind™Flex蛋白印迹处理仪
iBind™ Flex卡片损坏	更换新卡片。应确保膜在卡片上的移动仅限于标有“膜”的区域内。
膜与iBind™ Flex卡片接触不良	加入1 mL 1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液后，立即将膜放到iBind™ Flex卡片上。使用附带的滚轮，确保接触良好。
在运行结束前打开设备	卡片在设备中时，不要打开设备。重新密封卡片上的孔，可导致泄漏。
样品制备不当；抗原性减弱或损毁	SDS和还原剂可能干扰一些抗体/抗原亲和力
样品太稀	提高蛋白质样品的浓度，或增加上样量。
蛋白质与膜的结合较弱	转膜液应含10–20%甲醇。
曝光时间不足	对膜进行二次曝光，并延长曝光时间。
底物孵育不充分	应确保每一步都达到指定时间，或在达到可接受的信噪比时，从底物中取出印迹膜。
底物污染	始终佩戴手套，瓶子在未使用时始终保持拧紧状态。
印迹太旧	蛋白质会随时间降解。应使用新制备的印迹。

我使用iBind™Flex蛋白质免疫印迹处理系统时，得到了一个较大的分散信号。可能原因是什么？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
蛋白质上样量过高	减少上样量或稀释样品浓度。
转印效果差或转印不完全	重复转印。
一抗浓度过高	按照生产商的建议稀释一抗或通过点印迹法确定最佳抗体浓度。

最近使用iBind™ Flex蛋白质免疫印迹处理系统时，运行时间超过3小时。问题出在哪里？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
iBind™ Flex卡片损坏	更换新卡片。应确保膜在卡片上的移动仅限于标有“膜”的区域内。
膜组在运行前是湿的	应确保将5 mL 1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液加到iBind™ Flex卡片的平坦区。不要将溶液加到膜组上。
iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液准备不当	按照使用手册的说明，准备1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液。

我使用了iBind™ Flex蛋白质免疫印迹处理系统，结果膜上有很多点。可能原因是什么？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	重复转印。
膜的转印垫不干净或污染。	用转印垫前，用去污剂浸泡，然后用纯水彻底清洗。转印垫破损或变色后，则更换新的转印垫。
膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
封闭不均匀	孵育皿应足够小，使封闭液能够完全覆盖膜。
使用墨水标记膜	使用墨水对膜进行标记，仅限于印迹膜的低分子量区域。
iBind™ Flex卡片损坏	更换新卡片。应确保膜在卡片上的移动仅限于标有“膜”的区域内。
膜与iBind™ Flex卡片接触不良	加入1 mL 1X iBind™ Flex溶液/iBind™ Flex荧光检测（FD）溶液后，立即将膜放到iBind™ Flex卡片上。使用附带的滚轮，确保接触良好。

法学发光法或显色法检测

使用WesternBreeze™ AP底物时，人源组织裂解物的54 kDa条带是什么？

许多可消耗WesternBreeze™底物的人源碱性磷酸酶分子量接近50 kDa。它们有可能被作为约54 kDa的条带被检测到。已知这类蛋白质是二聚物，因此在非变性凝胶中可在110 kDa附近出现条带。

为什么使用SuperSignal化学发光底物看到的条带，比以往使用其他底物看到的条带更多？

因为SuperSignal底物比其他化学发给底物更灵敏，使您能够检测到之前看不到的低丰度蛋白。当使用更灵敏的底物时，需要对封闭液和抗体浓度进行更仔细的优化。

使用SuperSignal化学发光底物时，为什么整个膜都是黑色的或呈现为倒像？

抗体浓度（一抗和二抗）过高。按照产品说明稀释抗体。当使用了合适的封闭剂和HRP结合物浓度时，大部分背景会消失。

iBlot™ Western检测试剂盒

使用iBlot™ Western检测试剂盒后，有时会得到较高的膜背景。我该如何清除背景？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜污染	仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
PVDF膜本身具有较高的背景	改为使用硝化纤维素膜。
硝化纤维素膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
稀释添加剂与抗体稀释液的比例错误	应确保在制备抗体稀释液混合物时，使用适量的稀释添加剂（见使用手册第8页）。
印迹膜显色过度	遵循推荐的显色时间，当达到可接受的信噪比时，从底物中取出印迹膜。
使用了错误的程序	iBlot™蛋白质免疫印迹分析实验方案仅使用程序P9。
使用PVDF时，在底物中加入了增强剂	使用PVDF时，不要在化学发光底物中加入增强剂
洗膜不充分	遵循推荐的洗膜次数。在一些情况下，可能有必要增加洗膜次数和时间。
二抗浓度较高	按照使用手册的描述稀释二抗。如果背景仍然很高，但条带强度也很高，则应降低二抗的浓度。
一抗浓度较高	降低一抗浓度。

使用iBlot™ Western检测试剂盒时，该如何改善信号强度？

以下是信号弱/无信号的可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	检查转印条件或重复转印。使用阳性对照和/或分子量标记物。
使用硝化纤维素膜时，未在底物中加入增强剂	使用硝化纤维素膜时，在化学发光底物中加入增强剂。
硝化纤维素膜未完全湿润，或PVDF膜未完全再活化	按照使用手册第12页的说明，预润湿或再活化膜。
二抗浓度过低	按照使用手册第10页的说明，使用推荐的二抗浓度。
一抗浓度过低	将一抗浓度调整为标准免疫印迹检测所需一抗浓度的2倍。如果信号仍然很低并且背景不高，可增加浓度。
一抗失活	通过点印迹法或其他方法确定抗体活性。
一抗与抗原的亲和力较低	获取更高亲和力的一抗。
样品制备不当；抗原性减弱或损毁	SDS和还原剂可能干扰一些抗体/抗原亲和力
样品太稀	提高蛋白质样品的浓度，或增加上样量。
印迹太旧	蛋白质会随时间降解。应使用新制备的印迹。
稀释添加剂与抗体稀释液的比例错误	应确保在制备抗体稀释液混合物时，使用适量的稀释添加剂（见manual第8页）。
目标蛋白跑出凝胶	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。
蛋白质保留较差	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。使用具有相关大小蛋白质的分子量标记物。较大的蛋白质需要较长的转印时间，较小的蛋白质所需转印时间较短。使用具有适当结合能力的膜。

我使用iBlot™ Western检测试剂盒时，得到了非特异性结合。你们有何建议？

原因	解决方案
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
二抗浓度较高	按照使用手册第11页的描述稀释二抗。如果背景仍然很高，但条带强度也很高，则应降低二抗的浓度。
一抗浓度较高	降低一抗浓度。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。

结合使用iBlot™干转系统和iBlot™ Western检测试剂盒时，系统显示“错误2”信息。问题出在哪里？

以下是可能原因和解决方案：

短路或电流超过设备的极限。开盖15秒，使系统冷却。关闭盖子，按“开始/停止按钮”重新开始运行。如果问题依然存在，请发送邮件至联lifescience-CNTS@thermofisher.com系技术支持。
抗体稀释液混合物中的抗体稀释添加剂含量超过30%，引起电流升高和温度上升。应确保按照使用手册第8页的描述配制抗体稀释液混合物。

有时，在使用iBlot™ Western检测试剂盒检测完毕后，分子量（MW）标记物消失了。这是否表示蛋白质也不在了？

不。分子量标记物通常为预染的，比普通细胞蛋白质具有更高电荷。在免疫检测步骤中增设一个电场，可驱使分子量标记物正确通过膜而到达底部模组上。

但是，细胞蛋白质所带电荷比分子量标记物更少，并且在检测阶段不含有任何SDS。因此，使用iBlot™系统进行免疫检测时，细胞蛋白质会固定在膜上。

WesternDot™荧光免疫检测

我在使用WesternDot™二抗标记物进行荧光免疫检测时，得到的信号较弱。我该如何改善检测灵敏度？

许多因素可降低信号强度。其中一个主要因素是一抗。不同来源的一抗对目标抗原的亲和力差别很大。如果得到的信号较弱，可尝试使用不同供应商和/或不同宿主来源的一抗，这将有助于改善信号强度。

最初使用WesternDot™标记物时，可在印迹膜上看到信号，但几天后信号消失。为什么？

结合在干燥PVDF膜上的WesternDot™信号会衰减。为了将染色的印迹膜存档或在超过24小时以后成像，我们推荐使用硝化纤维素膜。

使用WesternDot™ 625试剂盒中的WesternDot™ Qdot™ 625链霉亲和素标记物进行检测后，我发现裂解物中有很多次要条带。为什么？

细胞裂解物样品中的许多内源性生物素化蛋白也会被链霉亲和素WesternDot™标记物检测到。将对照印迹膜放在链霉亲和素WesternDot™标记物中孵育，而不经过一抗和二抗孵育，可确定内源性生物素化蛋白。这些内源性生物素化蛋白条带在所有含有相同类型细胞裂解物的泳道中都是一致的，可将其作为上样内参或在免疫检测前使用内源性生物素染色封闭剂（货号E21390）将其封闭。

试管中的WesternDot™试剂出现了一些沉淀。我能否继续使用？

如果是大量沉淀，则可能表示试剂被冷冻过，应丢弃。在冷冻温度下，Qdot™探针将发生不可逆性聚集。保存于2-8℃时，形成少量沉淀属于正常情况。我们建议每次使用时将WesternDot™试剂在微型离心机中短暂离心，除去保存期间形成的所有少量沉淀，仅使用上清液。

使用WesternDot™检测后，得到了较高的背景。请问你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
封闭不充分或发生非特异性结合	尝试使用不同的封闭剂或增加封闭剂浓度。一般情况下，使用2%酪蛋白、5%脱脂奶粉或1/2x鱼血清可得到良好的结果。
使用BSA封闭膜	不要使用含BSA的溶液封闭或孵育WesternDot™标记物。对于不能兼容酪蛋白或牛奶（如许多抗磷蛋白抗体）的一抗，应使用鱼血清或含0.5% BSA的溶液进行一抗孵育，然后换成2%酪蛋白或5%脱脂奶粉完成所有其他孵育步骤。
膜污染	仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
PVDF膜本身具有较高的背景	改为使用硝化纤维素膜。
硝化纤维素膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
洗膜不充分	遵循推荐的洗膜次数。在一些情况下，可能有必要增加洗膜次数和时间。
一抗和/或二抗浓度过高	通过点印迹法确定最佳抗体浓度，必要时可稀释抗体。

使用WesternDot™检测试剂时，应如何改善信号强度？

以下是信号弱/无信号的可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	检查转印条件或重复转印。使用阳性对照和/或分子量标记物。
硝化纤维素膜未完全湿润，或PVDF膜未完全再活化	按照使用手册第12页的说明，预润湿或再活化膜。
二抗浓度过低	使用推荐的二抗浓度。
一抗浓度过低	将一抗浓度调整为标准免疫印迹检测所需一抗浓度的2倍。如果信号仍然很低并且背景不高，可增加浓度。
一抗失活	通过点印迹法或其他方法确定抗体活性。
一抗与抗原的亲和力较低	获取更高亲和力的一抗。
样品制备不当；抗原性减弱或损毁	SDS和还原剂可能干扰一些抗体/抗原亲和力。
样品太稀	提高蛋白质样品的浓度，或增加上样量。
印迹太旧	蛋白质会随时间降解。应使用新制备的印迹。
目标蛋白跑出凝胶	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。
蛋白质保留较差	较大的蛋白质需要较长的转印时间，较小的蛋白质所需转印时间较短。使用具有相关大小蛋白质的分子量标记物。使用具有适当结合能力的膜。
WesternDot™试剂被冷冻	在冷冻温度下，Qdot™探针会发生不可逆性聚集。

我使用WesternDot™检测试剂时，得到了非特异性结合。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
二抗浓度较高	按照推荐方法稀释二抗。如果背景仍然很高，但条带强度也很高，则应降低二抗的浓度。
一抗浓度较高	降低一抗浓度。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。

多色荧光免疫检测——Alexa Fluor™ 680和Alexa Fluor™ 790标记物

我使用Alexa Fluor™ 790和680二级标记物时，得到了较高的背景。我该如何降低背景？

在二抗孵育步骤中，向封闭剂中加入0.1% SDS，以进一步减少非特异性背景染色。使用低荧光PVDF-FL膜代替PVDF膜。

在Alexa Fluor™ 790和680检测后，得到了较高的背景。请问你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
封闭不充分或发生非特异性结合	尝试使用不同的封闭剂或增加封闭剂浓度。一般情况下，使用2%酪蛋白、5%脱脂奶粉或1/2x鱼血清可得到良好的结果。
使用BSA封闭膜	不要使用含BSA的溶液封闭或孵育Alexa Fluor™ 680和790标记物。对于不能兼容酪蛋白或牛奶（如许多抗磷蛋白抗体）的一抗，应使用鱼血清或含0.5% BSA的溶液进行一抗孵育，然后换成2%酪蛋白或5%脱脂奶粉完成所有其他孵育步骤。
膜污染	仅使用干净的新膜。始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。
PVDF膜本身具有较高的背景	改为使用硝化纤维素膜。
硝化纤维素膜未完全湿润	遵循预润湿膜的说明。
洗膜不充分	遵循推荐的洗膜次数。在一些情况下，可能有必要增加洗膜次数和时间。
一抗和/或二抗浓度过高	通过点印迹法确定最佳抗体浓度，必要时可稀释抗体。

使用Alexa Fluor™ 790和680检测试剂时，应如何改善信号强度？

以下是信号弱/无信号的可能原因和解决方案：

原因	解决方案
转印效果差或转印不完全	检查转印条件或重复转印。使用阳性对照和/或分子量标记物。
硝化纤维素膜未完全湿润，或PVDF膜未完全再活化	按照使用手册第12页的说明，预润湿或再活化膜。
二抗浓度过低	使用推荐的二抗浓度。
一抗浓度过低	将一抗浓度调整为标准免疫印迹检测所需一抗浓度的2倍。如果信号仍然很低并且背景不高，可增加浓度。
一抗失活	通过点印迹法或其他方法确定抗体活性。
一抗与抗原的亲和力较低	获取更高亲和力的一抗。
样品制备不当；抗原性减弱或损毁	SDS和还原剂可能干扰一些抗体/抗原亲和力
样品太稀	提高蛋白质样品的浓度，或增加上样量。
印迹太旧	蛋白质会随时间降解。应使用新制备的印迹。
目标蛋白跑出凝胶	应确保凝胶分离范围与待转印蛋白的大小是匹配的。
蛋白质保留较差	较大的蛋白质需要较长的转印时间，较小的蛋白质所需转印时间较短。使用具有相关大小蛋白质的分子量标记物。使用具有适当结合能力的膜。
Alexa Fluor™ 790和680试剂反复冻融	反复冻融会导致抗体发生不可逆性沉淀。长期保存时，最好在冷冻前将试剂分装到单独的管子中。

我使用Alexa Fluor™ 790和680试剂时，得到了非特异性结合。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。
二抗浓度较高	按照推荐方法稀释二抗。如果背景仍然很高，但条带强度也很高，则应降低二抗的浓度。
一抗浓度较高	降低一抗浓度。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。

BenchPro™ 4100卡片处理站

我在使用BenchPro™ 4100卡片处理站时，当开启电源后，我没有看到任何电源状态指示，数字显示是空白的，泵也不运行。我该怎么办？

以下是可能原因和解决方案：

交流电电源线未连接。检查交流电电源线两端的连接情况。使用正确的电源线。
保险丝熔断。更换保险丝（见使用手册第31页）。如果在确认使用了正确电源线并更换保险丝后，问题仍然存在，请发送邮件至lifescience-CNTS@thermofisher.com联系技术支持。

我刚开始使用BenchPro™ 4100卡片处理站，就出现了错误信息。哪里出错了？

请参考使用手册第30页的错误信息列表及相应措施。

使用BenchPro™ 4100卡片处理站时，如果不小心忘记加入卡片、试剂或试剂瓶，会发生什么情况？

我们建议您在开始实验方案之前，确认已按正确顺序加入了卡片、试剂和试剂瓶。如果在运行开始后中止运行，将需要重新开始。如果在运行开始后几分钟内中止运行，请不要重复使用卡片。

我发现很难将Western卡片插入到BenchPro™ 4100卡片处理站中。哪里出现问题？

以下是可能原因和解决方案：

未取下瓶盖。应确认将试剂瓶和试管放入试剂托盘时，已取下盖子。
卡片方向错误。将卡片插入到BenchPro™ 4100卡片处理站中，使吸头插入试管托盘上的试剂瓶和试管中。使用卡片对齐指南，确保将卡片正确插入槽内。当卡片正确插入槽内时，您将听到“咔哒”声。

我在使用BenchPro™ 4100卡片处理站时，印迹膜上的信号非常微弱或几乎没有信号。你们能否帮我排除故障？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
检测步骤缺失或检测试剂无效	仪器实验方案中不包含检测步骤。仪器实验方案完成后，应使用标准检测试剂和方案进行手动检测。应确认检测试剂是有效的。
在检测试剂中孵育不充分	在达到可接受的信噪比时，从检测试剂中取出印迹膜。
试剂加入顺序错误	为确保每一步都正确，应按照使用手册第13页所述的顺序加入试剂。
转印效果差或转印不完全	应确保转印装置和膜三明治组装正确。使用合适的转印时间。转印后，对膜进行染色以衡量转印效率。
目标蛋白跑出凝胶	使用阳性对照和/或分子量标记物来匹配凝胶分离范围和转印蛋白的大小。转印后，对膜进行染色以衡量转印效率。
样品太稀	增加蛋白质样品在凝胶上的上样量。
蛋白质保留较差或蛋白质与膜的结合较弱	转膜液应含10–20%甲醇。使用具有适当结合能力的膜。
一抗或二抗失活或稀释过度	通过点印迹法确定抗体活性。必要时可增加抗体浓度。

我在使用BenchPro™ 4100卡片处理站时，印迹膜上的背景非常高。你们有何建议？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
膜过度曝光或在曝光过程中变湿	缩短曝光时间或使信号进一步衰减。将膜放在透明薄膜中防止泄漏，并在曝光前从边缘吸去过量的底物。
封闭或洗膜时间太短	应确保每一步都达到指定时间。
一抗和/或二抗浓度过高	通过点印迹法确定最佳抗体浓度，必要时可稀释抗体。
接触膜的溶液、托盘或管子污染	使用干净的玻璃器皿和纯水制备溶液。使用纯水彻底清洗托盘。尽管使用温和去污剂清洗并用去离子水冲洗过的所有试剂瓶和试管都可以重复使用，但是，为防止任何试剂发生交叉污染，我们不建议重复使用25 ml试管。始终佩戴干净的手套。用镊子处理膜。
蛋白质上样量过高	减少上样量或稀释样品浓度。

我在使用BenchPro™ 4100卡片处理站时，得到了非特异性结合。为什么？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
SDS残留或转印后蛋白质与膜结合较弱	遵循免疫检测前的膜准备说明。
封闭时间过短或洗膜时间过长	应确保每一步都达到指定时间。
一抗对蛋白标准品具有亲和力	向蛋白标准品生产商咨询蛋白标准品与一抗的同源性。
膜被指纹或角蛋白污染	始终佩戴干净的手套并使用镊子来处理膜。处理膜时，仅触碰膜的边缘。

在BenchPro™ 4100卡片处理站开始运行程序后，什么原因可导致没有溶液泵入卡片印迹槽中或溶液泵入体积少于正常体积？

以下是可能原因和解决方案：

原因	解决方案
Western卡片没有在正确的位置	将卡片拉出并重新插入，确保将卡片一直插到底，直到听到“咔哒”声。
溶液吸头堵塞	检查溶液，特别是所有牛奶封闭液，查看是否存在可堵塞吸头的大颗粒。
卡片有缺损	尝试使用新卡片或尽可能不同批号的卡片[尝试使用新卡片，如果条件允许，尽可能使用不同批号的卡片。]。如果您怀疑卡片有问题，请发送邮件至lifescience-CNTS@thermofisher.com联系技术支持。
检查仪器的压力值和负压值	如果仪器的压力值明显低于248 kPa且负压值明显低于48 kPa，则可能存在硬件问题。请发送邮件至lifescience-CNTS@thermofisher.com联系技术支持。