昆虫表达支持 – 入门

是的，杆状病毒是表达毒性蛋白（即，膜蛋白）的良好候选方案。多角体启动子在感染后18-24小时才能表达至最高水平。多角体启动子在裂解晚期激活。也就是说，其在早期8小时的时候活性极低，所以，如果目的基因毒性很强，可能会造成问题。该问题的解决方法是转换到诱导型表达系统。跨膜蛋白通常难以在任何系统中表达。

昆虫细胞中的蛋白表达高峰，取决于感染复数（MOI）、感染时间和目标蛋白。系统优化包括使用MOI为5-10，表达时间为48-72小时。72小时后表达的蛋白可能是经过异常加工的，因为较高的病毒载量可引起细胞进程故障。

请遵循以下建议：

• 细胞应处于非常健康的状态，代数较低（5-15代），处于对数生长期，并且存活率高于95%。
• DNA必须高度纯化，无内毒素
• 转染时，不可使用抗生素
• Cellfectin试剂应完全重悬
• 设置对照组（培养基对照、DNA对照和转染试剂对照），用于对比和问题排查

贴壁Sf9细胞呈聚集状，接触点较小。感染后Sf9细胞聚集悬浮于培养液中，细胞体积变大。

是的，我们提供利用蜂毒素（HBM）分泌信号的Bac-to-Bac HBM TOPO分泌性表达系统（货号A11338或A11339）。该系统非常适用于研究毒性蛋白和糖蛋白。

需要。重组DNA存在未切割（occ+）DNA污染，将导致重组病毒随时间而逐渐稀释，因为未切割（野生型，occ+）病毒的感染和复制效率高于重组病毒。同时，使用纯化的、单一病毒群体进行起始表达，将确保得到可重复的结果。

如果培养基是无血清的，可加入血清至浓度为10%。血清蛋白可作为蛋白酶的底物，防止病毒外壳蛋白发生降解。将病毒储液置于4°C避光保存。分装储液可保存在–80°C，使用前应检测病毒滴度，因为冻融循环会导致病毒滴度降低10-100倍。

可以，可以进行大规模表达实验。下表描述了不同大规模实验方法、要求、优势和参考文献：

MOI或感染复数，是指某个实验中，感染单个细胞的平均病毒颗粒数量。您可使用以下公式计算MOI：

MOI (空斑形成单位(pfu)/细胞) = [滴度(pfu) x 接种物所用病毒储液体积(mL)] / [细胞密度(细胞/mL) x 培养物体积(mL)]

可以。多种五亚基蛋白，如人类复制因子C，已使用重组杆状病毒进行表达。为实现最佳的多亚基蛋白表达，我们建议生产出每个亚基的、独立的高滴度储液（HTS）。利用这种方法，可通过改变每个亚基HTS的感染复数，控制每个亚基的表达量。请参考以下文献，获取更多信息：

• Chen W and Bhal OP (1991) Recombinant carbohydrate and selnomethionyl variants of human choriogonadotropin. J Biol Chem 266(13):8192–8197.
• Chen WY and Bhal OP (1991) Selenomethionyl analog of recombinant human choriogonadotropin. J Biol Chem 266(15):9355–9358.
• Fabian JR, Kimball SR, Jefferson LS (1998) Reconstitution and purification of eukaryotic initiation factor 2B (eIF2B) expressed in Sf21 insect cells. Protein Expr Purif 13(1):16–22.

尽管Kozak序列在哺乳细胞翻译起始中的重要性已被证明，但昆虫细胞中是否也严格遵循Kozak规则仍有争议。确定其重要性的唯一方法是，对相同蛋白从不同起始序列的表达进行直接对比。即使这样，一种蛋白实现最佳表达所使用的规则可能并不适合其它蛋白。以下四篇文献证明了Kozak序列对昆虫细胞中的表达效率无任何影响：

• Hills D, Crane-Robinson C (1995) Baculovirus expression of human basic fibroblast growth factor from a synthetic gene: role of the Kozak consensus and comparison with bacterial expression. 
  Biochim Biophys Acta 1260(1):14–20.

• Ranjan A, Hasnain SE (1995) Influence of codon usage and translational initiation codon context in the AcNPV-based expression system: computer analysis using homologous and heterologous genes. Virus Genes 9(2):149–153.

驱动目的基因的启动子是多角体启动子。尽管对于大多数蛋白，多角体启动子通常强3-5倍，但该启动子可被p10启动子取代。然而，经高度修饰或分泌的蛋白在p10启动子的驱动下可达到更高的表达效率，因为p10启动子在末期阶段的早期激活，而多角体启动子在非常晚的末期才激活，两者正好相反。蛋白复合物高效和正确加工所需的细胞蛋白合成，在非常晚的末期停止。这解释了为什么一些报告提到在分泌和修饰蛋白的表达中，p10启动子与多角体启动子同样有效或p10启动子比多角体启动子的效率高2倍。但是，在大多数情况下，多角体启动子也有效。至于哪种启动子更强，取决于多种因素，包括蛋白质的性质和感染后的收获时间。

多角体蛋白为30 kDa。

我们的研发团队已成功表达了分子量高达300 kDa的蛋白。如果在血清含量>2%的培养基中表达，可将降解程度降至最低。如果您不介意采用额外的纯化步骤，可使用10%血清。为了确定获得最佳表达所需的最短收获时间，我们强烈推荐采用感染复数为5-10的高滴度储液进行不同时间的感染。每24小时为一个时间点，持续5天。

昆虫信号肽和/或前序列无法总是增强杆状病毒系统中外源分泌途径蛋白的表达和/或分泌。请查看以下文献：

• Jarvis DL, Summers MD, Garcia A Jr, Bohlmeyer DA (1993) Influence of different signal peptides and prosequences on expression and secretion of human tissue plasminogen activator in the baculovirus system. J Biol Chem 268(22):16754–16762.
• Tessier DC, Thomas DY, Khouri HE, Laliberte F, Vernet T (1991) Secretion of a plant protein in the baculovirus system was enhanced when its signal peptide was replaced with an insect-derived signal peptide. Gene (Amst.) 98:177–183.

杆状病毒的杆会根据包装DNA的需要而持续延伸。因此，理论上，该系统能够容纳几百个Kb。在包装极限成为问题之前，标准克隆技术将限制插入片段大小。

以下是关于如何防止杆状病毒表达系统中发生蛋白质水解作用的一篇很好的文献：

Hom LG, Volkman LE (1998) Preventing proteolytic artifacts in the Baculovirus expression system. BioTechniques 25:18–20.

5’测序引物：5’ – TAT TCC GGA TTA TTC ATA CC – 3’

3’测序引物：5’ – TTC AGG TTC AGG GGG AGG TG – 3’

预期的PCR片段大小取决于转座至杆状病毒质粒中的pFastBac™载体：

• 仅杆状病毒质粒：300 bp
• pFastBac™ 1：2300 bp + 插入长度
• pFastBac™ 1-Gus：4200 bp
• pFastBac™ HT：2430 bp + 插入长度
• pFastBac™ HT-CAT：3075 bp
• pFastBac™ Dual：2560 bp + 插入长度
• pFastBac™ Dual-Gus/CAT：5340 bp
• pDEST8：2316 bp + 插入长度
• pDEST10：2484 bp + 插入长度
• pDEST20：3031 bp + 插入长度

开始BaculoDirect™实验时，将目的基因克隆到Gateway入门载体中，随后利用LR Clonase反应克隆到BaculoDirect™载体中。将该载体转染到您的细胞中并生长3天。在第4天，收集P1病毒储液。再次感染细胞，生长3天。在第7天，收集P2病毒储液。感染细胞，在第10天收集蛋白并纯化。

我们建议使用Sf9或Sf21细胞，生成高滴度病毒储液。我们不推荐使用High Five™细胞生成病毒储液，因为其转染效率较低。生成高滴度病毒储液后，您可使用Sf9、Sf21、High Five™或Mimic™ Sf9细胞进行蛋白表达。

TK基因是利用更昔洛韦对非重组病毒进行负筛选。

利用杆状病毒信号序列，已有效分泌蛋白。请查看以下参考文献：

• Kuhn S, Zipfel PF (1995) The baculovirus expression vector pBSV-8His directs secretion of histidine-tagged proteins. Gene 162:225–229.
• Krol BJ, Murad S, Walker LC, Marshall MK, Clark WL, Pinnell SR, Yeowell HN (1996) The expression of a functional, secreted human lysyl hydroxylase in a baculovirus system. J Invest Dermatol 106:11–16.

研究者已成功使用蜂毒素分泌序列。请查看以下参考文献：

• Tessier DC, Thomas DY, Khouri HE, Laliberté F, Vernet T (1991) Enhanced secretion from insect cells of a foreign protein fused to the honeybee melittin signal peptide. Gene 98:177–183.
• Garnier L, Cahoreau C, Devauchelle G, Cérutti M (1995) The intracellular domain of the rabbit prolactin receptor is able to promote the secretion of a passenger protein via an unusual secretory pathway in lepidopteran cells. BioTechnology 13:1101–1104.
• Vihko P, Kurkela R, Porvari K, Herrala A, Lindfors A, Lindqvist Y, Schneider G (1993) Rat acid phosphatase: Overexpression of active, secreted enzyme by recombinant baculovirus-infected insect cells, molecular properties, and crystallization. Proc Natl Acad Sci U S A 90:799–803.
• Mroczkowski BS, Huvar A, Lernhardt W, Misono K, Nielson K, Scott B (1994) Secretion of thermostable DNA polymerase using a novel baculovirus vector. J Biol Chem 269:13522–13528.

在Bac-N-Blue™系统中，转移载体和杆状病毒DNA的重组发生于昆虫细胞中。Bac-N-Blue™载体是一种线性AcMNPV衍生物，含有不完整的(3’) lacZ片段。相应的转移载体含有一个5’ lacZ片段。在同源重组的基础上，重组Bac-N-Blue™杆状病毒DNA将具有一个受PETL启动子控制的lacZ基因。因此，重组Bac-N-Blue™杆状病毒在空斑实验中会形成蓝色空斑，易于识别。在Bac-to-Bac表达系统中，转移载体与杆状病毒DNA间的重组或位点特异性转座发生于大肠杆菌（DH10Bac）中。在Bac-to-Bac表达系统中，含重组杆状病毒DNA的菌落筛选发生于含50 μg/mL卡那霉素（杆状病毒质粒）、7 μg/mL庆大霉素（pFastBac™）、10 μg/mL四环素（辅助性质粒）、100 μg/mL Bluo-gal和40 μg/mL IPTG的Luria琼脂板上。

“野生型”表示可产生包涵体阳性（occ+）空斑的、未切割的Bac-N-Blue™ DNA。野生型空斑的出现率低于20%。

可以，任何含有ORF603和ORF1629序列的杆状病毒转移载体都可使用。

我们推荐使用以下序列设计正向和反向引物：

正向引物：5´-TTTACTGTTTTCGTAACAGTTTTG-3´ Tm = 62°C

反向引物：5´-CAACAACGCACAGAATCTAGC-3´ Tm = 58°C

这些引物的侧翼为多角体区域，可兼容所有基于多角体启动子的杆状病毒转移载体。利用O'Reilly等（1992年）的命名法，正向PCR引物的结合发生于多角体基因起始点前方的–44 (nt 4049)至–21 (nt 4072)。反向PCR引物的结合发生于多角体基因的+794 (nt 4886)至+774 (nt 4866) 3´。

我们建议您采用空斑实验法检测病毒储液的滴度。如果需要，您也可以利用空斑实验纯化单个病毒克隆。

以下是空斑实验法的主要步骤：

• 在6孔板中接种细胞，并使细胞到达80%融合
• 对P1病毒储液（1–10^-5）进行连续稀释，并加到细胞中
• 在27°C孵育1小时
• 在培养基中混合1%融化的琼脂糖
• 移除病毒上清液
• 在细胞上覆盖含琼脂糖的培养基
• 将培养板静置2-3小时，使琼脂糖完全凝固
• 培养10-14天
• 计算空斑数量

进行该实验时，我们建议：

• 细胞应处于非常健康的状态，代数较低（10-20代），处于对数生长期，并且存活率高于95%
• 确认病毒储液是无菌的（无污染）
• 使用高质量、低熔点的琼脂糖
• 琼脂糖培养基的温度非常重要——太热，则细胞会死亡；太冷，则琼脂糖凝固太快
• 覆盖琼脂糖培养基后等待2-4小时，使琼脂糖达到100%凝固
• 在稀释的板中，空斑数量按下述公式计算：

                  （1/稀释度）x 空斑数量 = pfu/mL
例如，如果在稀释度为10-6的板中形成50个空斑，则为1/(10^-6) x 50 = 5 x 10⁷ pfu/mL

请参见以下公式：

pfu/mL =空斑数量(pfu)/稀释系数x接种体积(mL)

例如，如果病毒稀释度为10^-8的孔中含有18个白色空斑，则病毒滴度计算为：

X pfu/mL = 18 pfu/10^-8 x 1 mL

X = 1.8 x 10⁹ pfu/mL

用于表达研究时，我们建议使用滴度为>1 x 10⁸ pfu/mL的病毒储液。

您可使用中性红或MTT对单层细胞进行染色，使空斑更明显。或者，您可延长室温下的空斑形成时间（平均2-5天），增强重组空斑的对比度。但是，中性红空斑染色法不适用于空斑纯化和病毒扩增。

繁殖病毒储液时，为避免缺陷性干扰颗粒（DIP）的影响，应使用低MOI（0.03–0.1）。低MOI可确保每个细胞的病毒颗粒感染量低于1，防止DIP扩增。当细胞存活率为15%时，是合适的病毒收获时间。

注意：DIP是接近正常的病毒衣壳，含缺陷性基因组，无法进行成功的复制。尽管该“颗粒”本身无感染性，但当它与正常病毒颗粒或一些其他类型的DI颗粒共感染时，可以进行复制。

这取决于病毒的加入量。如果感染细胞的MOI为5，则细胞通常在24小时被感染，细胞在65小时左右开始裂解。病毒使用量越少，则所需时间越长，反之亦然。

我们建议在细胞裂解率达到90%时，收获高滴度病毒。大约需要5-7天。如果延长细胞感染时间，则裂解细胞释放的蛋白酶会降解病毒表面蛋白，导致传染性病毒量降低。

我们的研发团队通常会将病毒加到含0.5 x 10⁶细胞/孔的12孔培养板中，每孔总体积为2.5 mL。大约3天后，取出0.75 mL培养液用于制备PCR用DNA，将剩余培养基收集至Eppendorf管中，作为P1病毒储液。此外，也可以挑选一个空斑，保存在Grace’s培养基中。

通常，每孔加入含0.5 x 10⁶个细胞的培养基2.5–3 mL，是一个良好的开端。第3天开始发生裂解。在第3-7天（90%细胞死亡），可收获和扩增病毒。

可以，杆状病毒可以感染哺乳细胞，但是需要非常高的滴度。杆状病毒在肝细胞中的感染能力最强。但是，只有在使用高滴度储液直接感染细胞时，才有交叉感染风险。

杆状病毒可以感染果蝇细胞，但不能在果蝇细胞中复制。普通杆状病毒系统中驱动目的基因表达的启动子都是晚期启动子，并且需要来自杆状病毒基因组的早期蛋白。因此，它们在S2细胞中无效，因为无法生成早期蛋白。

可以，用于制备P2病毒储液的实验方案也可用于制备P3、P4或P5病毒储液。我们不建议制备代数高于P5的储液，因为这会产生更多的缺陷型感染颗粒，并会降低蛋白表达水平。

如果该低滴度储液为P1或P2储液，则可用于病毒扩增实验方案。如果低滴度储液曾经是高滴度储液，但随着时间或繁殖多次而发生滴度降低，则需要重新制备高滴度储液。如果高滴度储液代数大于P5，则可能有过多的缺陷型干扰颗粒感染细胞，而不能进行适当复制或生成蛋白。如果将已有储液接种后，重新分离得到了新的空斑（DIP不会形成空斑），则该储液可用于制备高滴度储液。