昆虫表达支持 – 问题排查

请查看以下可能原因和建议：

• pFastBac™质粒或插入DNA消化不完全：使用更多的限制性内切酶消化或纯化插入DNA。
• 用于处理pFastBac™质粒的磷酸酶不足或过多：根据您使用的磷酸酶的生产商的建议，优化去磷酸化条件。
• 琼脂糖凝胶中pFastBac™质粒或插入DNA的回收率较低：使用我们的PureLink快速凝胶提取系统从琼脂糖凝胶中纯化出高质量的质粒DNA。
• 连接反应不充分：按照连接条件，通过改变载体与插入片段的摩尔比（1:3，1:1，3:1），优化连接反应条件。
• 插入片段含有不稳定的DNA序列，例如LTR序列和反向重复序列：使转化后细胞在较低温度（30°C）下生长或尝试使用不同的感受态细胞株，如MAX Efficiency Stbl2™感受态细胞。

请查看以下可能原因和建议：

• 感受态大肠杆菌的转化效率较低：如果保存方法不正确，则制备或获取新的感受态细胞。我们建议使用One Shot TOP10或One Shot MAX Efficiency DH10B™-T1R大肠杆菌化学感受态。
• DNA中含杂质：对插入DNA进行纯化。确保除去DNA溶液中所有多余的苯酚、蛋白质、去污剂和乙醇。
• DNA转化量过多：在每100 µL化学感受态细胞中，加入1-10 ng的DNA，体积为5 µL或更小。在每20 µL电转感受态细胞中，加入10–50 ng的DNA，体积为1 µL或更小。
• 连接反应不充分：优化连接反应，加入连接对照（如，消化的pFastBac™载体 + 连接酶；不含插入片段）。
• 连接反应混合物抑制感受态细胞的转化：减少转化的连接反应量。转化前，使用TE缓冲液将连接反应稀释5倍。
• 抗生素的问题：确认使用了正确的抗生素和抗生素浓度，以及抗生素的生产日期。
• 感受态细胞保存不恰当或处理不恰当：将感受态细胞保存于–80°C；在冰上复苏并立即使用；不可涡旋振荡。

尽管您将要挑选的是白色（重组）菌落，但是您也应该预期会看到一些蓝色（含非重组杆粒）菌落。以下是关于无蓝色菌落的可能原因和建议：

• 颜色形成时间不足：在鉴定菌落表型前，至少等待48小时。
• 在琼脂板中，使用Bluo-gal代替X-Gal：在板中使用Bluo-gal，可增强蓝白菌落的对比度。
• 转座后，生长不充分：接种前，使转化后细胞在SOC培养基中生长至少4小时。
• 培养板中缺少Bluo-gal和IPTG：制备含50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素、10 µg/mL四环素、100 µg/mL Bluo-gal和40 µg/mL IPTG的新鲜的选择性培养板。
• 培养板上菌落过多：连续稀释转化混合物，从而获得间隔合适的菌落（建议稀释度为10-2至10-4）。
• 培养板太久或在光照下保存：不要使用放置超过4周的培养板；培养板应避光保存。
• 孵育时间过短或温度过低：挑选菌落前，至少等待48小时。在37°C孵育培养板。

请查看以下可能原因和建议：

• 用于转化的pFastBac™ DNA质量较差：使用纯化的质粒DNA进行转化，检查质粒DNA的质量。
• 培养板中缺少庆大霉素：制备含50 µg/mL卡那霉素、7 µg/mL庆大霉素、10 µg/mL四环素、100 µg/mL Bluo-gal和40 µg/mL IPTG的新鲜的选择性培养板。

请查看以下可能原因和建议：

• 复苏/表达期间使用了LB培养基：在4小时的生长期使用SOC培养基。
• 复苏/表达时间过短：延长复苏时间，在37°C时为4小时以上，或在30°C时为6小时。
• IPTG浓度不理想：我们建议使用20–40 µg/mL IPTG。

我们建议利用PCR对重组杆粒DNA进行分析。使用pUC/M13正向和反向引物可帮助PCR分析，引物的杂交位点为lacZalpha互补区域内的mini-attTn7位点的侧翼。关于更多使用说明，请查看使用手册第32页。

菌落的颜色区别很小可能是因为：

• 琼脂的pH不正确：调整LB琼脂的pH至7.0。
• 蓝色强度太弱；应确保您使用的是Bluo-gal，而不是X-Gal。您也可尝试将Bluo-gal的浓度增加至300 µg/mL。
• 培养板上的菌落过多或过少：调整细胞的连续稀释度，从而获得最佳的菌落数量。
• 孵育时间过短或温度过低：接种后48小时，方可挑选菌落；在37°C孵育培养板。
• IPTG浓度不理想：IPTG浓度范围在20–60 µg/mL之间，通常可得到最佳的颜色区分。

这可能是因为：

• 使用了错误的抗生素或旧的培养基：应使用新鲜的培养基。
• 菌落太老或太小：从新划线的培养板上选取较大的白色菌落。
• 目的基因的特殊性质导致插入片段不稳定；例如，直接重复序列：应在30°C培养24小时，而不是在37°C培养过夜。

请查看以下可能原因和建议：

• DNA保存不恰当：为避免反复冻融，应将纯化的杆粒DNA分装保存在–20°C。
• 对高分子量杆粒DNA的处理不恰当：在分离杆粒DNA时，不要涡旋振荡DNA溶液；此外，不要机械地重悬DNA沉淀；将溶液置于管内，轻轻敲打几次。

以下是针对该问题的可能原因和建议：

• 使用纯的校正聚合酶进行分析：使用Taq聚合酶进行分析。
• 插入片段太长，导致PCR出现问题：使用与您的M13引物成对的基因特异性引物，代替使用M13正向和反向引物。
• 在目的基因中，富含GC长片段：在PCR反应中，考虑使用DMSO（高达8%）。

这可能是因为来自杆粒制备的污染或细胞毒性。应设置无Cellfectin II试剂的杆粒阴性对照组。此外，在制备杆粒时，应使用PureLink HiPure质粒制备试剂盒，而不是基于硅胶的小量提取试剂盒。

有多种可能原因：

• 转染所用培养基含有抗生素。
• 细胞接种密度过低：我们建议细胞汇合度至少达到70%。
• 所用细胞代数过低：我们建议细胞用于转染前，至少生长5代。
• 转染后未使用青霉素/链霉素，导致污染：加入转染混合物孵育5-8小时后，移除混合物，并在每孔中加入含有抗生素的培养基。

请查看以下可能原因和建议：

• Cellfectin II试剂与杆粒没有混合或孵育时间不足：通过敲打或轻轻涡旋，混匀Cellfectin II试剂与杆粒，孵育混合物15-45分钟。
• 杆粒得率低于预期：使用不同剂量的杆粒进行优化。
• 杆粒在纯化或冻融过程中被剪切：在凝胶上验证杆粒的完整性。
• 孵育时间不足：将混合物在27°C孵育8小时。
• 所用细胞代数过高或已过对数生长期：为获得最佳结果，使用代数在8-15代之间的细胞；接种时，细胞应处于对数生长期。
• Cellfectin II试剂被冷冻过：购买新的试剂。
• 所用培养基含有血清：转染时，使用无添加的Grace’s培养基。

检查MOI。P1病毒的滴度低于估计值，可能导致MOI较低。

请查看以下可能原因以及关于提高得率的建议：

• 转染效率较低：建议使用我们的Cellfectin II试剂进行转染；在无添加的Grace’s培养基中进行转染，确保转染时所用培养基无添加、无FBS、无抗生素。当观察到可见的感染迹象时，收获病毒上清液（通常在转染后96小时以后）。
• 细胞接种密度过稀；应确认使用推荐的细胞密度。
• Cellfectin II转染试剂用量过多或过少：应优化用量。
• DNA-脂质体复合物的孵育时间过短或过长：优化孵育时间（3-8小时）。
• 重组杆粒DNA发生降解：在转染前，使用琼脂糖凝胶电泳，检验重组DNA的质量；使用PureLink HiPure质粒DNA小量提取或大量提取试剂盒，提取杆粒DNA。
• 杆粒DNA不纯（含有重组或空杆粒）：为分离重组杆状病毒，应筛选其他DH10Bac转化子并进行空斑纯化。

蛋白得率较低可能是因为：

• 病毒储液含有重组和非重组杆状病毒的混合物：通过空斑纯化，分离重组杆状病毒。
• 杆状病毒不是重组的：利用pUC/M13正向和反向引物对杆粒DNA进行PCR分析，对转座进行验证；使用新的重组杆粒DNA再次转染昆虫细胞。
• 病毒滴度过低或过高：改变MOI。
• 收获细胞的时间点不理想：采用针对表达的时间进程实验，确定获得最高蛋白表达水平的最佳时间。
• 细胞生长条件和培养基不理想：根据培养瓶的尺寸和表达条件，优化细胞培养条件；为获得最佳的细胞生长和蛋白表达，我们建议使用Sf-900™ II SFM或Sf-900™ III SFM。
• 所用细胞系不理想；尝试使用其他昆虫细胞系。
• 细胞收获过晚：做一个时间进程实验，在不同时间点收获细胞。

这种情况可发生于：

• 蛋白折叠需要蛋白的结合伴侣或其他部分：鉴定结合蛋白，并将两种蛋白共表达。
• 蛋白是天然分泌的，但现在表达为细胞内蛋白：将蛋白作为分泌型蛋白进行表达。
• 蛋白提取不恰当：为实现完全提取，使用超声处理和DNase I。始终保持样品低温。
• 可能需要可溶性标签：考虑使用N端GST标签。

放大后，应调整MOI和收获时间。

请查看以下可能原因和解决方案：

• 使用较高的起始MOI扩增病毒储液：使用低代数病毒储液，进行低MOI扩增。
• 收获病毒上清液时，未离心和除去细胞：重新使用低代数病毒储液，进行低MOI扩增；如果该病毒储液代数为P2，则该储液可用于扩增。
• 某些基因可使病毒变得非常不稳定：拿出分装的P2病毒储液，复苏后进行扩增。

用于培养昆虫细胞的培养基通常具有酸性pH（6.0-6.5）或含有电子供应基团，可阻止6xHis标签蛋白与Ni-NTA发生结合。昆虫细胞生长培养基所含谷氨酰胺、甘氨酸或组氨酸等氨基酸的浓度显著高于哺乳细胞生长培养基，这些氨基酸可与6xHis标签蛋白竞争Ni-NTA基质上的结合位点。例如，Grace’s培养基（Life Technologies）含有约10 mM谷氨酰胺、10 mM甘氨酸和15 mM组氨酸。

使用含适当成分和pH（8.0）的缓冲液对培养基进行透析，透析用缓冲液与在天然条件下进行纯化所使用的推荐裂解缓冲液相似，通常可恢复最佳的结合条件。应注意，选用的培养基可能导致出现白色沉淀（可能由不溶性盐组成），但6xHis标签蛋白通常留在溶液中。使用无蛋白质的培养基时，可通过蛋白质定量进行检测；或者利用免疫印迹分析法检测6xHis标签蛋白的含量。离心后，可从清澈的上清液中直接纯化6xHis标签蛋白。

如果您在使用SF-900™ II SFM，它与乙酸铵沉淀法不兼容。我们的SF-900™ II无血清培养基含有大量共聚物非离子表面活性剂Pluronic F-68，它已被发现会干扰乙酸铵沉淀。如果您将未浓缩的上清液加到纯化柱上，则应该没有问题。如果上清液经过浓缩，则需要使用柱子除去Pluronic酸。

在37°C水浴中温浴更昔洛韦5-10分钟，然后涡旋数分钟。沉淀应该重新溶解于溶液中。

请查看以下建议：

• 在转染到昆虫细胞中之前，利用PCR分析检验LR反应。
• 在转染实验中，我们建议使用无添加的Grace’s昆虫细胞培养基代替无血清培养基，因为无血清培养基中的有些成分可能干扰转染。
• 转染期间，应保证无FBS、无添加剂、无抗生素，因为这些物质中的蛋白质会干扰Cellfectin II试剂。
• LR重组反应中，以pENTR/CAT质粒为阳性对照，以Cellfectin II试剂（模拟转染）作为阴性对照。
• 确保细胞处于对数生长期，存活率高于95%，细胞使用量应与使用手册的建议一致。
• 若转染效率较低，细胞可能需要1周时间才能出现病毒感染迹象；继续培养，同时每日观察细胞的感染迹象。

为得到高滴度储液，应使用P1储液再次感染细胞并生成P2高滴度储液。按照BaculoDirect™使用手册第18页的说明，生成P2储液。

请检验入门克隆的构建，应确保插入片段位于载体读码框内。在LR反应后，利用PCR法分析重组病毒DNA，确认插入片段的大小和方向均正确。对PCR产物进行测序，确认用于表位标签表达的读码框正确。

请查看以下建议：

• 所用MOI不正确；应确保对病毒储液用量进行正确计算；所用MOI为5-10。您可能需要根据重组蛋白表达的动力学，测试MOI的范围。
• 蛋白质可能在细胞裂解过程中丢失；如果您检测的是细胞内蛋白，则应该对上清液进行分析，从而确定蛋白质是否因细胞裂解而丢失。
• 蛋白质降解了或不稳定；在细胞裂解物中加入蛋白酶抑制剂，和/或检验mRNA水平。
• 目标蛋白对细胞具有毒性作用；在较早的时间点收获细胞（如，感染后18-24小时）。

请对比仅有细胞的培养板和感染的培养板。与感染的细胞相比，未感染的细胞应表现为过度生长状态，因为转染会抑制生长。如果出现这种情况，应继续每日观察感染细胞是否有其他感染迹象（核肿胀、脱离培养板、病毒出芽以及裂解）。感染动力学可能比预期慢。如果细胞生长未出现抑制现象，您可考虑以下因素：

• DNA是如何提取的？我们建议使用树脂DNA纯化系统，例如我们的PureLink HiPure质粒提取试剂盒。
• 细胞是否处于对数期？汇合度是多少？为实现成功转染，我们建议使用处于对数生长期的细胞，存活率至少为95%，并以50-70%的汇合度进行接种。
• 使用的转染试剂是什么？我们建议使用Cellfectin II试剂。

如果您所有的样品中都有野生型病毒污染，则使用P1病毒储液重新进行空斑实验。应确保选择间隔合适的、occ-空斑。如果您难以对重组空斑和非重组空斑进行区分，可尝试使用一种pBlueBac载体。在琼脂糖覆层时，若在培养基中加入显色底物，则重组空斑为蓝色（想要获取更多信息，请参见使用手册第14页）。

感染动力学可能比预期要慢。继续观察培养板，直至感染后第8-9天。如果未出现空斑，则检查下面各项：

• 如果细胞不健康，会产生较差的空斑或无空斑产生。理想状态下，细胞应处于对数生长中期，并且存活率大于90%。在感染导致细胞停止生长前，细胞应至少倍增1次。应确保细胞接种量正确，且汇合度约为70%。
• 细胞营养不良和健康状态较差，都会抑制病毒复制周期。
• 琼脂糖温度也很关键。在琼脂糖覆层后，应将培养板静置1小时，使琼脂糖完全凝固。
• 在27°C孵育时，过度冷凝会抑制空斑形成——一旦发生冷凝，就应移除纸巾或打开装有培养板的容器。
• 病毒滴度过低：使用较高的病毒滴度。您可能需要再次感染细胞，并收集更高滴度的病毒储液。

通常使用的MOI在5-10之间。如果加入过多病毒，会导致细胞过早死亡，并使蛋白表达水平降低。

细胞接种过多；我们建议在6孔板的每孔中接种8 x 10⁵个细胞。

是的，这表明空斑上存在吸液问题。琼脂糖覆层“漂浮”，是因为板中的培养基未被全部吸走。将琼脂糖覆盖到细胞上之前，培养板应完全干燥，特别是在将要挑选空斑时。为达到这样的效果，我们通常会将培养板稍微倾斜，用Pasteur移液管沿培养板边缘吸一圈，同时小心不要破坏细胞单层。如果培养板边缘有任何培养基残留（小液滴），则继续吸液。琼脂糖覆层“漂浮”，也可能导致野生型病毒污染。野生型病毒可以迁移到培养板的其他部分，从而污染重组型空斑。野生型病毒比重组型病毒复制得快的多，可迅速超过重组型病毒。

琼脂糖覆层过热。加入琼脂糖覆层后，细胞应仍然保持圆形和健康状态。

有几种原因可导致培养板变蓝：

• 病毒接种量过多。可尝试使用更高的稀释度。
• 加入热的融化琼脂糖时，将细胞烫死了。过热的琼脂糖会使细胞裂解，将lacZ释放到琼脂糖中，使其变蓝。应复查铺板温度。如果培养板过湿，蓝色会扩散。

在打算挑选空斑的那一天，制备含Bluo-gal的DMSO溶液，浓度为20 mg/mL。在每个板中加入50 µL，使用玻璃涂布器在无菌条件下涂布。等待30-60分钟，空斑应变为蓝色。

正常情况下，约5-7天会出现很小的白点，约10天出现1 mm空斑。空斑的大小范围为1 mm至4 mm。

是的，细胞被单个野生型病毒感染后，会以不同速度生成多角体，直到培养瓶中所有的细胞都被感染。细胞中多角体的形成需要3-4天左右，其大小和数量各不相同，直至达到最大能力并发生细胞破裂，从而将微小的病毒颗粒释放到培养基中。

这是同源性重组较差的典型标志。应检查使用的质粒/线性DNA比例。但是，如果存在一些蓝色空斑，则对那些病毒进行扩增并检测它们的蛋白。根据我们的经验，它们应该是正确的，即使其丰度相对较低。

若出现蓝色菌落，则大肠杆菌含有杆粒和质粒，使细胞能在筛选过程中存活。但是，由于未发生转座，所以LacZ基因未被破坏。靶心菌落表示在菌落生长时发生转座。将从混合克隆白色部分中分离得到的克隆重新划线，应该能够得到发生过转座的菌落。

庆大霉素浓度可能过高。尝试降低庆大霉素的浓度至5 µg/mL，并在培养基中加入更多菌落。