电穿孔 - 疑难解答

使用Neon设备所获得转染效率较低的可能原因包括：

1. 电学参数未优化彻底
2. 所制备质粒中盐份较高
3. 质粒大于10 kb
4. 质粒浓度过低
5. 细胞应激，受损，或被支原体污染
6. 细胞密度过低或过高
7. 细胞传代次数过多

使用Neon设备后细胞存活率较低的可能原因包括：

1. 电学参数未优化彻底
2. 质粒品质不佳，如存在内毒素污染
3. 所制备质粒中盐份较高
4. 质粒用量过多
5. 细胞应激或受损
6. 多次使用同一Neon枪头
7. 枪头中存在微小气泡，从而导致电弧作用

是的。我们推荐您以琼脂糖凝胶来检验DNA的完整性，观察其是否发生降解。超螺旋的质粒会比线性质粒泳动得更快。带切口的质粒将比线性质粒泳动得更慢。您所制备DNA产物中的“带切口”DNA成份应低于20%。更高比例的带切口DNA会导致转染效率的显著下降。

是的。为了检查DNA的质量，我们强烈建议您检测A260:A280的比值。对于品质良好的DNA制备物，该比值至少应达到1.6以上。

不会，这些沉淀是不可逆的。如果该Neon试剂盒仍在1年有效期内，请联系技术支持部门进行更换。 

对于大质粒而言，制备高度浓缩的质粒十分重要。就对照质粒而言，10 mL电转需使用0.5 mg的数量，对照质粒的大小为5.5 kb左右。让我们假设所使用的大质粒为50 kb。它差不多有对照质粒的50倍大小，这样您就需要使用10倍质量的质粒来满足摩尔数。这样您就需要在10 mL电转体系中使用5 mg质粒。为了覆盖这一巨大的质粒量，质粒浓度就需要超过 5mg/mL。需要牢记的是当您加入大量质粒时，质粒样本本身即可造成毒性，从而损伤细胞。因此，我们推荐优化和减少质粒的起始用量，经检测细胞活力和转染效率再提高质粒用量。 

这一现象有几种可能的原因：单核细胞与巨噬细胞会响应极低水平的内毒素（LPS），而后者可能由您的质粒DNA引入的。请确保您使用的质粒DNA经过例如PureLink HiPure质粒纯化试剂盒一类的阴离子交换层析法的纯化。如果您仍然观察到激活现象，您可能需要对质粒进行第二轮的阴离子交换层析纯化。如果您仍无法避免细胞激活的现象，则质粒中可能包含了刺激gamma干扰素合成的序列。也可能您的培养基（包括本批FBS）中存在某些成份导致了激活效应。请确保没有这些成份激活细胞。分离单核细胞的步骤也同样很重要。我们推荐阴性筛选而非阳性筛选，因为这样的筛选过程能够让单核细胞不“碰触”抗体。我们的电转缓冲液能够确保不含内毒素成份，因此不会导致单核细胞/巨噬细胞的激活。

如需测定siRNA的Neon转染效率，我们推荐使用荧光标记的阴性对照siRNA来转染细胞（BLOCK-iTTM荧光寡聚物，目录编号13750062），并通过检测活细胞中荧光染色细胞的百分比来确定转染效率。不过，在使用此方法时请切记：通过荧光标记的阴性对照siRNA所确定的转染效率有高估转染效率的可能，这是因为通过显微镜进行的荧光检测无法区分进入胞内的siRNA和粘附在胞膜上的siRNA。如需更为准确地测定转染效率，需要使用阳性对照siRNA（如靶向看家基因的siRNA）转染细胞，再检测靶标RNA或蛋白的敲低效果即可。

电弧作用可由DNA制备物中较高的盐份，高细胞密度和枪头活塞末端形成气泡等原因导致。请观察活塞底部是否出现微型气泡，这些气泡可能由急速的加样操作所致，或由过于剧烈混匀的样本产生。你应以平缓连续的动作来进行加样，以避免吸入空气。

如果您检查了所有上述原因后仍遇到严重的电弧问题，那么可能是您使用了一批旧枪头，这些枪头活塞的阻抗可能已经较低，从而导致气泡形成和电弧。如果确是这一原因所致，我们则建议您换用一批新枪头。