电穿孔 - 疑难解答

使用Neon设备后细胞存活率较低的可能原因包括：

1. 电学参数未优化彻底
2. 质粒品质不佳，如存在内毒素污染
3. 所制备质粒中盐份较高
4. 质粒用量过多
5. 细胞应激或受损
6. 多次使用同一Neon枪头
7. 枪头中存在微小气泡，从而导致电弧作用

是的。我们推荐您以琼脂糖凝胶来检验DNA的完整性，观察其是否发生降解。超螺旋的质粒会比线性质粒泳动得更快。带切口的质粒将比线性质粒泳动得更慢。您所制备DNA产物中的“带切口”DNA成份应低于20%。更高比例的带切口DNA会导致转染效率的显著下降。

是的。为了检查DNA的质量，我们强烈建议您检测A260:A280的比值。对于品质良好的DNA制备物，该比值至少应达到1.6以上。

不会，这些沉淀是不可逆的。如果该Neon试剂盒仍在1年有效期内，请联系技术支持部门进行更换。 

对于大质粒而言，制备高度浓缩的质粒十分重要。就对照质粒而言，10 mL电转需使用0.5 mg的数量，对照质粒的大小为5.5 kb左右。让我们假设所使用的大质粒为50 kb。它差不多有对照质粒的50倍大小，这样您就需要使用10倍质量的质粒来满足摩尔数。这样您就需要在10 mL电转体系中使用5 mg质粒。为了覆盖这一巨大的质粒量，质粒浓度就需要超过 5mg/mL。需要牢记的是当您加入大量质粒时，质粒样本本身即可造成毒性，从而损伤细胞。因此，我们推荐优化和减少质粒的起始用量，经检测细胞活力和转染效率再提高质粒用量。 

这一现象有几种可能的原因：单核细胞与巨噬细胞会响应极低水平的内毒素（LPS），而后者可能由您的质粒DNA引入的。请确保您使用的质粒DNA经过例如PureLink HiPure质粒纯化试剂盒一类的阴离子交换层析法的纯化。如果您仍然观察到激活现象，您可能需要对质粒进行第二轮的阴离子交换层析纯化。如果您仍无法避免细胞激活的现象，则质粒中可能包含了刺激gamma干扰素合成的序列。也可能您的培养基（包括本批FBS）中存在某些成份导致了激活效应。请确保没有这些成份激活细胞。分离单核细胞的步骤也同样很重要。我们推荐阴性筛选而非阳性筛选，因为这样的筛选过程能够让单核细胞不“碰触”抗体。我们的电转缓冲液能够确保不含内毒素成份，因此不会导致单核细胞/巨噬细胞的激活。

如需测定siRNA的Neon转染效率，我们推荐使用荧光标记的阴性对照siRNA来转染细胞（BLOCK-iTTM荧光寡聚物，目录编号13750062），并通过检测活细胞中荧光染色细胞的百分比来确定转染效率。不过，在使用此方法时请切记：通过荧光标记的阴性对照siRNA所确定的转染效率有高估转染效率的可能，这是因为通过显微镜进行的荧光检测无法区分进入胞内的siRNA和粘附在胞膜上的siRNA。如需更为准确地测定转染效率，需要使用阳性对照siRNA（如靶向看家基因的siRNA）转染细胞，再检测靶标RNA或蛋白的敲低效果即可。

电弧作用可由DNA制备物中较高的盐份，高细胞密度和枪头活塞末端形成气泡等原因导致。请观察活塞底部是否出现微型气泡，这些气泡可能由急速的加样操作所致，或由过于剧烈混匀的样本产生。你应以平缓连续的动作来进行加样，以避免吸入空气。

如果您检查了所有上述原因后仍遇到严重的电弧问题，那么可能是您使用了一批旧枪头，这些枪头活塞的阻抗可能已经较低，从而导致气泡形成和电弧。如果确是这一原因所致，我们则建议您换用一批新枪头。