볼륨 전자 현미경 검사를 위한 연속 블록 페이스 이미징

자연 상태에서 세포와 조직의 복잡한 3D 구조를 밝히는 것은 생물학적 시스템의 구조와 기능의 상관관계에 있어 매우 중요합니다. 최근 몇 년 동안 큰 조직 볼륨의 3D 재구성을 위해 SEM 기반 방법이 상당한 발전을 이루었습니다. 연속 블록 페이스 SEM(SBF-SEM)은 SEM 진공 챔버 내에서 원위치(in situ) 절편 생성과 플라스틱-임베딩 조직 블록의 이미징을 결합하여 큰 조직 볼륨을 완전 자동화된 방식으로 재구성합니다. 지금까지 축 분해능은 블록 페이스에서 절단할 수 있는 최소 절편 두께로 인해 제한되었지만, SBF-SEM 및 다중 에너지 디콘볼루션 SEM(MED-SEM)을 결합한 Thermo Scientific Volumescope 2 SEM은 이제 진정한 등방성 3D 분해능으로 큰 볼륨에 대한 이미징을 가능하게 합니다.

연속 블록 페이스 이미징 동안 전자빔은 먼저 레진-임베딩된 조직 시료의 표면을 스캔하여 시료의 2D 이미지를 캡처하는데 사용됩니다.

이 상단 표면은 원위치(in situ) 마이크로톰을 사용하여 순차적으로 제거될 수 있습니다. 각 절단면의 두께는 사용자가 정의하지만, 일반적으로 15-20 µm 보다 큽니다. 이 절단면을 폐기하면 파편 수집 장치에 의해 수집됩니다.

그런 다음, SEM을 사용하여 새 표면의 이미지가 수집됩니다. 이 과정이 샘플 전체가 이미징될 때까지 반복됩니다. 총 샘플 높이는 수십 마이크로미터에서 수백 마이크로미터 또는 그 이상일 수 있습니다. 그런 다음, 연속적인 이미지 스택이 3D 렌더링 소프트웨어를 통해 처리됩니다.

관심 영역 국지화, 다중 영역 또는 다양한 이미징 검출기 등 샘플 요구 사항과 특정 사용자에 맞게 연속 블록 페이스 이미징 프로세스를 최적화하고 조정할 수 있습니다.

다중 에너지 디컨볼루션 SEM(MED-SEM)은 기계적 절편 생성과 광학 절편 생성을 결합하여 축 분해능을 개선하는 새로운 방법입니다. 다이아몬드 나이프로 블록 페이스의 원위치(in situ) 절편을 생성한 후, 새롭게 노출된 조직을 점진적 가속 전압을 사용하여 여러 번 촬영합니다. 이어서 여러 광학적 표면하부 층을 도출하기 위해 디컨볼루션 알고리즘에 이러한 이미지를 적용하여 3D 하위세트를 형성합니다. Volumescope 2 SEM은 이러한 주기의 반복을 통해 10 nm의 Z 분해능을 가진 등방성 데이터세트를 제공합니다.

시각화 소프트웨어인 Thermo Scientific Amira를 사용하여 세포 소기관 형태를 3D로 정량화하는 표준화된 프로토콜을 통해 이러한 세포 하부 구조의 정확하고 재현 가능한 측정이 가능합니다. 미토콘드리아 및 소포체(ER) 구조를 정량화하기 위해 SBF-SEM 및 Amira 소프트웨어를 사용하여 프로토콜을 적용했습니다.

“예전에 저는 웹 서핑을 했습니다. 지금은 데이터세트 서핑을 합니다. 구조는 기능이며 세포 생물학의 교리입니다.”

Mayo Clinic의 Jeffrey Salisbury 교수는 정상 및 질병 상태의 조직, 신장, 뇌로부터 다양한 검체의 3D 구조를 관찰하기 위해 연속 블록 페이스 이미징을 이용한 최근의 3D 검사 등 다양한 생물학적 질문에 대한 답을 얻기 위해 45년 이상 쌓아온 현미경 검사 노하우를 공유합니다.

"정말 흥미로운 시간이며, 마침내 실제 세포 생물학을 연구할 수 있는 기회를 얻게 되었습니다. 지난 몇 년 동안 기다려만 왔는데 빨리 시작하고 싶습니다."

Purdue Electron Microscopy Center의 책임자인 Christopher Gilpin은 3D 이미징 기술의 맥락에서 연속 블록 페이스 이미징과 생물학적 멀티스케일 맵핑에 대한 잠재적인 사용에 대해 설명합니다.