GeneArt® Type IIs 클로닝은 간단합니다. in vitro 구축반응(assembly reaction) 후 competent E. coli로 형질전환되는 단 2단계의 공정으로 이루어지는 Golden Gate 법을 기반으로 합니다. Type IIs restriction endonuclease는 인지부위(recognition site)에서 정해진 거리에 있는 비대칭 염기서열을 인식하여 절단합니다. DNA 말단은 이러한 분절 절단이 효소 인지부위를 제거하고 상보성 돌출부위(complementary overhangs)를 생성하도록 Type IIs 제한 부위 측면에 배치되도록 설계할 수 있습니다. 그러한 말단은 균일하게 결합하여 원래의 부위 또는 흔적이 없는 접합부(junction)를 생성할 수 있습니다.

GeneArt® Type IIs kit 를 이용하여

  • 단일 또는 여러(최대 8) DNA 분절을 어떤 순서로든 모든 호환 벡터로 흔적 없이 조립할 수 있습니다.
  • 동종 또는 반복 서열을 클로닝할 때 동종 재조합 및 관련 재배열을 피할 수 있습니다.
  • GeneArt® Strings™ DNA Fragments, GeneArt® Precision TALs, 유전자 변이체, 반복 서열을 조립할 수 있습니다.
  • 맞춤 벡터로 나만의 클로닝 및 발현 벡터를 만들 수 있습니다.
  • 최종 구성체의 서열확인에 필요한 시간과 노력을 최소화할 수 있습니다.
  • 3가지 Type IIs 효소(AarI, BsaI, BbsI) 중 어떤 것으로든 하나를 이용하여 제한/연결(ligation) 반응을 실시할 수 있습니다. 각 10-반응 키트에는 all-in-one 효소 혼합물, 클로닝 벡터, 클로닝 대조가 들어 있습니다.
  • 효율적 조립(assembly)를 위해  GeneArt® Primer와 Construct Design Tool을 사용하십시오.

 

Figure 1. GeneArt® Type IIs Assembly Kit 사용 시 가능한 다양한 클로닝 전략의 개요. (A) Type IIs 제한효소와 ligase를 병용한 두 분절의 균일한 조립 다이어그램. 분절과 해당 말단의 염기서열은 보라색과 녹색으로 표시되어 있습니다. 분절에 추가된 adaptor는 빨간색으로 표시됩니다. 밑줄은 Type IIs restriction endonuclease BsaI에 대한 인지부위를 나타냅니다. (B) 두 가지 클로닝 시나리오에 대한 다이어그램: 두 PCR 분절의 벡터로의 클로닝(왼쪽)과 두 공여 플라스미드(donor plasmid)로부터 단일 벡터로의 분절 이동 및 조립 (오른쪽). 검은색 화살표는 제한부위에서 시작하여 절단부위를 가리키는 제한부위의 방향을 나타냅니다. (C) 하나의 공여 플라스미드로부터 다양한 특성을 갖는 여러 벡터(예: 세균 vs 포유동물발현, RNAi 발현 등을 위한 서로다른 벡터) 로 단일 분절의 전송이 쉬움을 나타내는 다이어그램. 화살표와 약어는 (B)와 같습니다. (D) 수용벡터(recipient vector) pType-IIs의 벡터 지도 Amp, ampicillin 내성 유전자; Kan, kanamycin 내성 유전자; CamR, chloramphenicol 내성 유전자; ccdB, ccdB 역선별 표지자(counter-selectable marker).

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Figure 2. 다양한 유형의 DNA insert와 GeneArt® Type IIs Assembly kits. 각각의 경우, 클로닝 효율성은 집락(colony) 수가 아닌 정확한 순서와 배향의 정확한 삽입물(insert)로 정의됩니다. (A) AarI를 사용한 GeneArt® Strings™ DNA Fragment의 조립. (B) 직접 또는 사전 클로닝 PCR 산물의 조립. (C) 반복 (TAL 또는 동일 서열 등) 또는 작은 연기서열의 조립.

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