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Immunoprecipitation(IP)을 위한 제품 및 솔루션
문헌 동향에따르면 가장 빠르게 늘고 있는 immunoprecipitation 방법에는 마그네틱 비드가 사용되며 Invitrogen Dynabeads 제품은 이러한 참고문헌에서 가장 많이 사용되고 참조되는 제품입니다. 그 이유는, Dynabeads 마그네틱 비드가 특정 단백질(예: immunoprecipitation, IP)과 단백질 복합체(co-immunoprecipitation, co-IP)의 소규모 분리를 위한 최고의 용량/수율, 재현성, 순도 및 비용의 균형을 제공하기 때문입니다.
많은 양의 단백질 또는 항체의 정제 능력에 초점을 두었던 1970년대에 아가로스(agarose) 기반 "Sepharose slurry"가 도입된 이후 단백질 정제 및 연구 니즈(needs)가 크게 변화하였습니다. 이것이 주된 응용 분야인 경우, agarose/resin 기반 컬럼은 여전히 가장 좋은 방법 중 하나입니다.
번들로 제공되는 IP starter-pack으로 21 ~ 24% 절약
여기에서 IP starter-pack을 확인하십시오.
페이지 내용
- IP용 마그네틱 비드의 장점
- 작동 원리(마그네틱 비드가 있는 IP)
- 올바른 immunoprecipitation 제품 찾기
- Antibody-binding IP 제품
- Biotin-binding IP 제품
- Fusion protein IP 제품
- Benchmarking data: Dynabeads vs. 다른 제품
- IP 문헌 동향
- 동영상
- IP starter pack – 21 ~ 24% 절약
IP용 마그네틱 비드의 장점
마그네틱 비드는 기존의 Sepharose agarose 또는 다른 agarose-based resin보다 빠르고, 더 간편하고, 더 효율적인 방법으로 관심 단백질을 끌어당길 수 있기 때문에 immunoprecipitation 및 pull-down assay의 골드 스탠다드가 되었습니다. Dynabeads 마그네틱 비드는 낮은 비특이적 결합과 저렴한 비용으로 높은 수율과 재현성 간에 최상의 균형을 달성하도록 도와줍니다. Dynabeads 마그네틱 비드의 장점을 시각적으로 이해하는데 도움이 되는 IP 신화 동영상을확인하십시오.
Dynabeads 기술의 장점 요약:
- 낮은 백그라운드—고순도 단백질 수율을 위해 비특이적 결합이 없거나 최소이며 사전 제거 불필요
- 높은 재현성—균일한 비드로 가장 일관된 결과 보장
- 높은 민감도—소량 단백질의 ChIP 및 IP와 같은 민감한 애플리케이션용으로 가장 자주 인용되는 방법
- 빠르고 간편함—원심분리 또는 사전 제거 단계가 없는 40분 이하의 프로토콜
- 항체 절감—모든 결합은 비드의 바깥쪽 표면에서 일어나므로 이를 통해 귀중한 항체를 보존하며 샘플당 저비용 고효율 솔루션 지원
- 유연성—IP, Co-IP, pull-down, ChIP 분석용 제품, 수동 및 자동 프로토콜에 이상적
- IP 프로토콜의 자동화—Thermo Scientific KingFisher 플랫폼이 immunoprecipitation 자동화를 어떻게 지원하는지 알아보십시오.
작동 원리(마그네틱 비드가 있는 IP)
Dynabeads 마그네틱 비드를 단백질 분리를 위한 견고한 지지물로 사용하면 immunoprecipitation을 간단한 4단계로 쉽고 빠르게 수행할 수 있습니다.
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This procedure is simple, fast, requires no preclearing step, and results in high-target protein purity, yield, and consistent results.
This procedure is simple, fast, requires no preclearing step, and results in high-target protein purity, yield, and consistent results.
- 비드에 항체 결합. Dynabeads 마그네틱 비드는 단백질 A, 단백질 G, anti-mouse IgG 또는 anti-rabbit IgG 항체로 사전코팅(precoated) 되며 빠른 동태학으로 인해 10분만에 첨가된 항체에 결합합니다. 바이오티닐화 항체는 streptavidin-결합된 Dynabeads와 함께 사용할 수도 있습니다. 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 자석에서 비드를 한 번 씻어냅니다.
- 비드에 샘플 추가. 결합된 항체가 있는 세척된 비드에 단백질 함유 샘플을 추가하고 관심 표적 단백질에 결합하도록 10분간 인큐베이션합니다. 단백질의 존재비가 낮거나 친화성이 낮으면 인큐베이션 시간을 1시간 또는 하룻밤으로 늘릴 수 있습니다. 그러나 일반적으로 10분 인큐베이션으로 충분합니다.
- 단백질 결합 비드 세척. 결합된 표적 단백질의 높은 순도를 보장하려면 결합되지 않은 모든 단백질을 제거하기 위해 자석에서 비드를 buffer로 2-4회 세척해야 합니다. 효율적인 분리 공정은 높은 signal-to-noise ratio를 보장합니다.
- 단백질 용리. 필요한 경우, 가벼운 용리 절차 또는 변성 용리 절차를 사용하여 단백질을 비드에서 용리할 수 있습니다(자세한 내용은 아래 용리 설명 참조).
비드상의 재조합 단백질 A 및/또는 단백질 G는 알부민 결합 부위를 함유하지 않으므로 오염 단백질의 co-purification을 피합니다. 용액에서 비드에 대한 항체의 결합은 평형 반응입니다. 가능한 많은 항체를 캡처하기 위해 반응 부피를 낮게 유지하여 고농도의 비드 및 항체를 유지해야 합니다. 샘플(점성 샘플도 포함)을 전처리할 필요가 없으므로 샘플이나 비드를 희석하지 않아야 합니다. 샘플의 항체 농도가 매우 낮은 것으로 의심되면 비드의 양을 늘릴 수 있습니다.
비드로부터 항체를 용리시키는 방식의 대안으로 Dynabeads를 Na-phosphate buffer에 재현탁시킬 수 있습니다. 동시 용리를 방지하기 위해 immunoprecipitation 전에 비드상의 단백질 A/G에 항체를 cross-link시킬 수 있습니다. 이것은 다운스트림 SDS-PAGE에 이은 autoradiography 또는 western blotting에는 필요하지 않으며 silver 또는 coomassie dye staining에 대해서는 선택 사항입니다.
단백질을 인식하는 항체가 있는 경우 선택하십시오.
항체 결합 제품의 선택은 다운스트림 어세이에 따라 달라집니다.
항체 결합이 가장 일반적인 방법이며 표적 항체가 비드에 직접 결합되거나 마그네틱 비드의 pre-coated ligand에 간접적으로 결합될 수 있는 경우에 사용됩니다.
항체 결합 제품 선택 가이드
항체 결합 제품 선택 가이드
| 단백질 A, G, A/G | 2차 항체 (anti-mouse, anti-rabbit) | 표면 활성화 비드(에폭시)* | |
|---|---|---|---|
| 결합 특성 | Non-covalent 항체 결합 | Non-covalent 항체 결합 | Covalent 항체 결합 |
| 항체가 비드에서 동시 용리됨 | 예† | 예† | 아니오 |
| ligand 유형 | 각기 다른 ligand는 각기 다른 특이성으로 각기 다른 종 및 항체 아형에 결합합니다.‡ | Anti-mouse는 mouse IgG1, IgG2a, IgG2b에 결합하고, anti-rabbit는 모든 rabbit IgG에 결합합니다. | 모든 항체 |
| 질량 분석기 사용 가능 | 예(단백질 A/G), 검증되지 않음(단백질 A, G) | 아니오 | 예 |
| 비특이적 결합 | 낮음 | 낮음 | 매우 낮음 |
| 항체 결합 시간 및 온도(RT=실온) |
| >30분, 2–8°C | 16–24시간, 37°C |
| 제품 | 비드만 포함:키트: | 비드만 포함: | 키트: |
* 추가 표적의 결합 및 캡처를 위한 더 많은 표면 활성화 Dynabeads 제품을 확인하십시오.
† 항체의 동시 용리를 피하기 위해 교차결합이 수행될 수 있지만 이는 표적 항원의 수율을 감소시킬 수 있습니다.
‡ 해당 IP 항체에 가장 적합한 항체 결합 단백질을 알아보십시오.
† 항체의 동시 용리를 피하기 위해 교차결합이 수행될 수 있지만 이는 표적 항원의 수율을 감소시킬 수 있습니다.
‡ 해당 IP 항체에 가장 적합한 항체 결합 단백질을 알아보십시오.
단백질을 인식하는 바이오티닐화 항체(또는 리간드)가 있는 경우 선택하십시오.
IP에 Streptavidin-coated beads와 함께 바이오티닐화 항체를 사용할 때의 주요 장점은 다음과 같습니다.
- 가용성 IgG가 풍부한 샘플이 있는 경우
- Fc 영역이 없는 재조합 항체가 있는 경우
- 실험실에 이미 Streptavidin-coated Dynabead가 있는 경우
- 질량 분석법과 호환되는 비드가 필요한 경우(2차 코팅 및 epoxy-coated Dynabead는 질량 분석법과 호환 가능)
유연성을 위해 4가지 유형의 streptavidin-coupled Dynabeads가 제공됩니다. 다양한 특성을 확인하려면 Dynabeads streptavidin 선택 가이드를 참조하십시오.
지난 25년간 streptavidin-coupled Dynabeads는 biotinylated ligand와 함께 널리 사용되어 왔으며 다양한 수동 및 자동 애플리케이션용으로 수천 건의 자료에 인용되었습니다. Streptavidin Dynabeads에 가장 널리 사용되는 애플리케이션은 핵산 정제 및 차세대 서열분석(NGS) 워크플로우용이지만 immunoprecipitation(IP)에도 사용됩니다.
재조합 (fusion tagged) 단백질이 있는 경우 선택하십시오.
재조합 단백질 발현을 위한 인기 있는 fusion tag는 다음과 같습니다.
- His tag—6개 ~ 9개의 히스티딘 잔기로 구성되며 immobilized metal affinity chromatography (IMAC)를 통한 정제에 주로 사용됨
- GST tag—완전한 211 아미노산 단백질(26 kDa)인 glutathione S-transferase(GST)로 구성되며 glutathione agarose resin를 통한 정제에 주로 사용됨
- HA tag—인간 인플루엔자 hemagglutinin(HA) protein으로부터 유래된 펩타이드(YPYDVPDYA)로 구성되며 immobilized anti-HA 항체는 HA-tagged recombinant protein을 면역침전시키는데 사용됨
- c-Myc tag—인간 c-myc 종양 유전자(p62 c-myc)로부터 유래된 펩타이드(EQKLISEEDL)로 구성되며 immobilized anti-c-Myc 항체는 immunoprecipitate c-Myc-tagged recombinant proteins 을 면역침전시키는데 사용됨
- FLAG tag—immobilized high-affinity rat monoclonal antibody (clone L5)에 의해 인식되는 펩타이드(DYKDDDDK)로 구성되며 부드러운 정제 과정이 상호작용을 방해하지 않는 경향이 있기 때문에 다수의 소단위를 갖는 단백질 복합체의 분리에 주로 사용됨
His 및 GST는 일반적으로 특정 항체를 통해 정제되거나 검출되지 않기 때문에 진정한 epitope tag가 아닙니다. 이와 달리 HA 및 c-Myc tag는 정제 또는 검출의 유일한 수단이 특정 항체를 통해 이루어지기 때문에 진정한 항원결정인자 태그입니다. Epitope tags 는 대량 정제에 거의 사용되지 않지만 immunoprecipitation 또는 co-immunoprecipitation (IP, co-IP)에 가장 많이 사용됩니다. 그러나 이 4가지 태그 시스템 모두 정제 또는 pull-down 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
캡처하려는 단백질을 인식하는 바이오티닐화 항체가 있는 경우 이 제품들 중 하나를 사용하여 자체적인 친화성 제품을 만들 수 있습니다.
단백질을 인식하는 항체가 있는 경우 선택하십시오.
항체 결합 제품의 선택은 다운스트림 어세이에 따라 달라집니다.
항체 결합이 가장 일반적인 방법이며 표적 항체가 비드에 직접 결합되거나 마그네틱 비드의 pre-coated ligand에 간접적으로 결합될 수 있는 경우에 사용됩니다.
항체 결합 제품 선택 가이드
항체 결합 제품 선택 가이드
| 단백질 A, G, A/G | 2차 항체 (anti-mouse, anti-rabbit) | 표면 활성화 비드(에폭시)* | |
|---|---|---|---|
| 결합 특성 | Non-covalent 항체 결합 | Non-covalent 항체 결합 | Covalent 항체 결합 |
| 항체가 비드에서 동시 용리됨 | 예† | 예† | 아니오 |
| ligand 유형 | 각기 다른 ligand는 각기 다른 특이성으로 각기 다른 종 및 항체 아형에 결합합니다.‡ | Anti-mouse는 mouse IgG1, IgG2a, IgG2b에 결합하고, anti-rabbit는 모든 rabbit IgG에 결합합니다. | 모든 항체 |
| 질량 분석기 사용 가능 | 예(단백질 A/G), 검증되지 않음(단백질 A, G) | 아니오 | 예 |
| 비특이적 결합 | 낮음 | 낮음 | 매우 낮음 |
| 항체 결합 시간 및 온도(RT=실온) |
| >30분, 2–8°C | 16–24시간, 37°C |
| 제품 | 비드만 포함:키트: | 비드만 포함: | 키트: |
* 추가 표적의 결합 및 캡처를 위한 더 많은 표면 활성화 Dynabeads 제품을 확인하십시오.
† 항체의 동시 용리를 피하기 위해 교차결합이 수행될 수 있지만 이는 표적 항원의 수율을 감소시킬 수 있습니다.
‡ 해당 IP 항체에 가장 적합한 항체 결합 단백질을 알아보십시오.
† 항체의 동시 용리를 피하기 위해 교차결합이 수행될 수 있지만 이는 표적 항원의 수율을 감소시킬 수 있습니다.
‡ 해당 IP 항체에 가장 적합한 항체 결합 단백질을 알아보십시오.
단백질을 인식하는 바이오티닐화 항체(또는 리간드)가 있는 경우 선택하십시오.
IP에 Streptavidin-coated beads와 함께 바이오티닐화 항체를 사용할 때의 주요 장점은 다음과 같습니다.
- 가용성 IgG가 풍부한 샘플이 있는 경우
- Fc 영역이 없는 재조합 항체가 있는 경우
- 실험실에 이미 Streptavidin-coated Dynabead가 있는 경우
- 질량 분석법과 호환되는 비드가 필요한 경우(2차 코팅 및 epoxy-coated Dynabead는 질량 분석법과 호환 가능)
유연성을 위해 4가지 유형의 streptavidin-coupled Dynabeads가 제공됩니다. 다양한 특성을 확인하려면 Dynabeads streptavidin 선택 가이드를 참조하십시오.
지난 25년간 streptavidin-coupled Dynabeads는 biotinylated ligand와 함께 널리 사용되어 왔으며 다양한 수동 및 자동 애플리케이션용으로 수천 건의 자료에 인용되었습니다. Streptavidin Dynabeads에 가장 널리 사용되는 애플리케이션은 핵산 정제 및 차세대 서열분석(NGS) 워크플로우용이지만 immunoprecipitation(IP)에도 사용됩니다.
재조합 (fusion tagged) 단백질이 있는 경우 선택하십시오.
재조합 단백질 발현을 위한 인기 있는 fusion tag는 다음과 같습니다.
- His tag—6개 ~ 9개의 히스티딘 잔기로 구성되며 immobilized metal affinity chromatography (IMAC)를 통한 정제에 주로 사용됨
- GST tag—완전한 211 아미노산 단백질(26 kDa)인 glutathione S-transferase(GST)로 구성되며 glutathione agarose resin를 통한 정제에 주로 사용됨
- HA tag—인간 인플루엔자 hemagglutinin(HA) protein으로부터 유래된 펩타이드(YPYDVPDYA)로 구성되며 immobilized anti-HA 항체는 HA-tagged recombinant protein을 면역침전시키는데 사용됨
- c-Myc tag—인간 c-myc 종양 유전자(p62 c-myc)로부터 유래된 펩타이드(EQKLISEEDL)로 구성되며 immobilized anti-c-Myc 항체는 immunoprecipitate c-Myc-tagged recombinant proteins 을 면역침전시키는데 사용됨
- FLAG tag—immobilized high-affinity rat monoclonal antibody (clone L5)에 의해 인식되는 펩타이드(DYKDDDDK)로 구성되며 부드러운 정제 과정이 상호작용을 방해하지 않는 경향이 있기 때문에 다수의 소단위를 갖는 단백질 복합체의 분리에 주로 사용됨
His 및 GST는 일반적으로 특정 항체를 통해 정제되거나 검출되지 않기 때문에 진정한 epitope tag가 아닙니다. 이와 달리 HA 및 c-Myc tag는 정제 또는 검출의 유일한 수단이 특정 항체를 통해 이루어지기 때문에 진정한 항원결정인자 태그입니다. Epitope tags 는 대량 정제에 거의 사용되지 않지만 immunoprecipitation 또는 co-immunoprecipitation (IP, co-IP)에 가장 많이 사용됩니다. 그러나 이 4가지 태그 시스템 모두 정제 또는 pull-down 응용 분야에 사용할 수 있습니다.
캡처하려는 단백질을 인식하는 바이오티닐화 항체가 있는 경우 이 제품들 중 하나를 사용하여 자체적인 친화성 제품을 만들 수 있습니다.
Benchmarking data: Dynabeads vs. 기타 IP 솔루션
이 섹션에는 Dynabead와 다른 마그네틱 솔루션 및 resin기반 솔루션의 결과를 비교하여 보여주는 비교 데이터가 포함되어 있습니다. IP에 Sepharose 또는 agarose bead slurry 를 계속 사용하는 경우, 면역침전에 대한 4가지 신화를 파헤친 유익한 애니메이션을 보고 싶을 수 있습니다.
resin-based 솔루션과 비교한 Dynabeads
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그림 1. Dynabeads 마그네틱 비드를 사용하면 프로토콜 시간이 단축되고 수율이 향상됩니다. 제조사의 프로토콜에 따라 Ab 함량 및 세포 용해물 부피와 관련하여 동일한 양의 샘플 물질을 모든 IP 프로토콜에 사용하였습니다. Dynabeads 기반 방법의 경우, 최적의 재현 가능한 항원 결합을 위해 비드 표면의 모든 항체에 액세스할 수 있습니다.
마그네틱 솔루션과 비교한 Dynabeads
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그림 2. 선택한 마그네틱 비드가 결과에 영향을 미칩니다. Dynabeads 마그네틱 비드는 불필요한 결합 단백질을 포획하는 내부 표면 없이 필요한 결합을 수행하기 위해 정의된 표면을 가지고 있습니다. (A) Dynabeads 제품은 높은 수준의 재현성이 가능하도록 고도로 제어된 제품 품질로 제조된 가장 균일한 monodisperse superparamagnetic beads입니다. (B–D) 다른 공급업체의 마그네틱 입자는 불순물을 포획하는 다양한 모양과 크기를 가지므로 재현성이 떨어지고 비특이적 결합이 증가합니다.
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그림 3. 벤치마킹 데이터에 따르면 Dynabeads 마그네틱 제품은 최고 수율과 최저 수준의 비특이적 결합의 조합을 고려할 때 최고의 성능을 발휘합니다. 당사의 마그네틱 비드는 가장 빠른 프로토콜을 제공하므로 불필요한 단계를 제거하여 실험실 수명을 개선할 수 있습니다.
각 starter pack 에는 DynaMag-2 자석이 있습니다. 가장 적합한 starter pack 을 선택하십시오.
이 번들 조합을 사용하면 별도로 구매할 때보다 21-24%가 절약됩니다.
| 카탈로그 번호 | 구성 | 테스트 번호 |
|---|---|---|
| 10013D | Dynabeads Protein A, 2 x 1 mL + DynaMag-2 | 40 |
| 10014D | Dynabeads Protein G, 2 x 1 mL + DynaMag-2 | 40 |
| 10015D | Dynabeads Protein A, 1 mL Dynabeads Protein G, 1 mL + DynaMag-2 | 40 |
| 10016D | Dynabeads Protein A, 5 mL + DynaMag-2 | 100 |
| 10017D | Dynabeads Protein G, 5 mL + DynaMag-2 | 100 |
| 카탈로그 번호 | 구성 | 테스트 번호 |
|---|---|---|
| 10018D | Dynabeads Protein A, 2 mL + DynaMag-2 + Washing and elution buffers | 40 |
| 10019D | Dynabeads Protein G, 2 mL + DynaMag-2 + Washing and elution buffers | 40 |
면역침전 문헌 동향
면역침전에 관한 문헌 동향이 모든 것을 말해줍니다. 면역침전 절차를 위한 Dynabeads 마그네틱 비드와 다른 기술 및 제품의 효용을 비교하여 인용한 문헌의 수가 급증하고 있습니다.
Dynabeads IP 인용.
Dynabeads ChIP 인용.
자동화 면역침전(immunoprecipitation)과 다운스트림 질량분석기(mass spec) 분석
Dynabeads 마그네틱 비드를 사용한 immunoprecipitation에 이은 전형적인 다운스트림 단백질 분석은 웨스턴 블롯(Western blot) 또는 질량 분석기(Mass spectrometry)로 수행됩니다. 한 번에 다수 샘플을 처리하고 KingFisher 장비 상에서 IP 공정을 자동화하는 연구자들의 수가 증가하고 있습니다. 아래는 KingFisher Flex 플랫폼 상에서 Dynabeads를 사용하고 이어서 질량분석기(Mass spec) 분석을 수행하는 전형적인 워크플로우(workflow) 몇몇을 설명하는 최근 발행물입니다.
- Brinkmalm A, Öhrfelt A, Bhattacharjee P, Zetterberg H. Detection of α-Synuclein in Biological Samples Using Mass Spectrometry.Methods Mol Biol. 2019;1948:209-220. doi: 10.1007/978-1-4939-9124-2_16.
- Cicognola C, Brinkmalm G, Wahlgren J, Portelius E, Gobom J, Cullen NC, Hansson O, Parnetti L, Constantinescu R, Wildsmith K, Chen HH, Beach TG, Lashley T, Zetterberg H, Blennow K, Höglund K. Novel tau fragments in cerebrospinal fluid: relation to tangle pathology and cognitive decline in Alzheimer's disease.Acta Neuropathol. 2019 Feb 137(2):279-296 10.1007/s00401-018-1948-2. Epub 2018 Dec 13.
- Gkanatsiou E, Portelius E, Toomey CE, Blennow K, Zetterberg H, Lashley T, Brinkmalm G. A distinct brain beta amyloid signature in cerebral amyloid angiopathy compared to Alzheimer's disease. Neurosci Lett. 2019 Jan 14;701:-131. doi: 10.1016/j.neulet.2019.02.033. Epub 2019 Feb 23.
- Kvartsberg H, Lashley T, Murray CE, Brinkmalm G, Cullen NC, Höglund K, Zetterberg H, Blennow K, Portelius E. The intact postsynaptic protein neurogranin is reduced in brain tissue from patients with familial and sporadic Alzheimer's disease. Acta Neuropathol. 2019 Jan;137(1):89-102. 10.1007/s00401-018-1910-3. Epub 2018 Sep 22.
- Öhrfelt A, Brinkmalm A, Dumurgier J, Brinkmalm G, Hansson O, Zetterberg H, Bouaziz-Amar E, Hugon J, Paquet C, Blennow K. The pre-synaptic vesicle protein synaptotagmin is a novel biomarker for Alzheimer's disease.Arthritis Res Ther. 2016 Oct 3 8(1):531541.
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