Active Site Probe 및 효소 강화 키트 개요

본 제품은 ActivX Biosciences, Inc.로부터 라이선스를 받은 Activity-Based 단백질 프로파일링 기술을 기반으로 합니다.

Pierce 단백질법

Active site probe 키트를 사용하면 다음과 같은 일들이 가능해집니다.

• 조직, 세포, 세포 이하 proteome으로부터의 kinase 및 G-단백질 등의 뉴클레오티드 결합 단백질의 광범위한 보강
• 소규모 분자의 용량 의존적 프로파일링
• 기능 중심 효소의 보강
• 수십개에서 수백개의 억제제 표적 및 표적 이외의 프로파일링

Thermo Scientific Pierce Active Site Probe는 kinases, GTPase, serine hydrolase와 같은 특정 효소 계열의 활성 부위에 공유결합한 화학적 probe 입니다. Thermo Scientific Pierce Active Site Probe는 샘플 전반에서 표적 효소 계열을 선택적으로 보강, 확인 및 프로파일링하거나 효소 억제제의 특이도 및 친화력 평가에 사용할 수 있습니다. Probe의 구조는 활성 부위 특이적 반응기, linker 영역, 검출 또는 친화력 확인을 위한 태그 그룹으로 이루어져 있습니다. 활성 부위 반응기는 보통 효소의 활성 부위에서 친핵성 잔기에 공유결합하는 친전자성 화합물입니다. 모든 활성 부위 probe는 소분자에 의한 효소 억제 측정에 사용할 수 있으며, 일부 probe는 활성 효소들과만 우선적으로 반응하여 ABPP(activity-based proteomic profiling) 역시 가능하게 합니다.¹

하나의 활성부위 probe 계열은 ATP, ADP 또는 GTP 뉴클레오티드 유도체를 기반으로 합니다. ATP 및 ADP기반 probe는 공유결합을 통해 kinase, chaperone 및 대사 효소등을 포함하는 ATPase의 활성 부위를 변형시킵니다.² GTP probe는 특히 작은 GTPase 및 G 단백질 결합 수용체 GTPase 서브유닛을 표지합니다. 많은 kinase, GTPase 및 기타 뉴클레오티드 결합 단백질이 효소적 불활성 상태에서도 뉴클레오티드 또는 억제제에 결합하므로, 본 시약은 복합 샘플에서 불활성 및 활성 효소를 모두 정제할 수 있습니다. 활성 부위 probe와 경쟁하는 소분자 억제제를 이용한 샘플의 사전 배양을 통해 억제제 결합 친화력을 측정할 수 있습니다. 또한, 뉴클레오티드 probe에 대한 활성 부위를 표적 이외의 억제제 측정에도 사용할 수 있습니다.

Kinase, 기타 ATPase 또는 GTPase에 대한 Thermo Scientific Active Site Probe의 기전 및 화학 구조. A. 뉴클레오티드 유사체는 ATPase 또는 GTPase의 활성 부위에 결합하며, 비오틴 친화 태그는 활성 부위에서 매우 보존적인 lysine 잔기로 비가역적으로 이동됩니다. B. Desthiobiotin 뉴클레오티드 유사체의 구조. Streptavidin에 대한 desthiobiotin 결합은 산성 용출 조건에서 쉽게 역전되어 표지된 단백질 및 펩티드의 높은 회수를 가능하게 합니다. Desthiobiotin은 불안정한 acyl phosphate 결합을 통해 뉴클레오티드에 부착하여, 활성 부위 주변의 amine으로 desthiobiotin 표지를 효율적으로 전달합니다. ATP 및 ADP 뉴클레오티드 유사체 표지는 ATPase의 상보집합(complementary set)으로, 활성 부위 근처에서 보존된 lysine에 대한 acyl phosphate 결합 근접성의 차이에 기인한 것일 수 있습니다.

Fluorophosphonate (FP) probe는 활성 serine hydrolase에 특이적인 또 다른 계열의 활성 부위 probe입니다.³  본 시약은 활성 효소만을 표지하므로, 효소 활성을 모니터링할 수 있을 뿐 아니라 억제제의 결합 친화력 시험에도 이용할 수 있습니다. Serine hydrolase 계열에는 cholinesterase, hydrolase, lipase, protease 유사 trypsin, kallikrein, dipeptidyl peptidase와 같은 다양한 효소들이 포함됩니다. 이러한 많은 효소들이 불활성 pro-protein으로 발현되기 때문에, 이러한 probe의 활성 평가능은 특히 양적인 부분만을 측정하는 기존 단백질 또는 RNA 발현 프로파일링 기법에 비해 장점을 갖습니다.

Serine hydrolase에 대한 Thermo Scientific Active Site Probe의 기전 및 화학구조. A. Fluorophosphonate probe는 효소 활성을 갖는 serine hydrolase 및 protease의 활성 부위에서 특이적으로 공유결합을 합니다. B.  표지, 친화력 강화 또는 표지된 효소의 형광 검출을 위한 azido, desthiobiotin 및 형광 fluorophosphonate probe의 구조.

Active site probe는 세포 용해질, 준세포분획, 조직 및 재조합 단백질에 대한 소분자 억제제 스크리닝에 사용할 수 있습니다. 활성 부위 probe 태그 group 및 프로파일링 될 효소 계열에 따라, 활성 부위 표지 효소는 웨스턴 블롯, 형광 겔 영상촬영 또는 질량 분광분석법을 통해 검출 및 정량할 수 있습니다. Desthiobiotin 태그된 probe는 웨스턴 블롯(western blot)에 의한 활성 부위 표지 단백질의 보강 및 검출 모두에 사용할 수 있으며, 질량 분광분석법으로 확인 및 정량할 수 있는 활성 부위 표지 펩티드의 보강에도 사용할 수 있습니다. 이러한 방법들을 통해 단 한 번의 분석으로 수백개 효소에 대한 고효율 표적 정량을 할 수 있습니다.

1. Cravatt, B.F., Wright, A.T., and Kozarich, J.W. (2008). Activity-based protein profiling: From enzyme chemistry to proteomic chemistry. Annu. Rev. Biochem. 77:383?414.
2. Patricelli, M.P., et al. (2007). Functional interrogation of the kinome using nucleotide acyl phosphates. Biochemistry 46:350-358.
3. Liu, Y., Patricelli, M.P., Cravatt, B.F. (1999). Activity-based protein profiling: The serine hydrolases. PNAS 96(26):14694-14699.