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SARS-CoV-2에 대한 Collibri Next-Generation Sequencing의 최적화 프로토콜
SARS-CoV-2 바이러스의 차세대 염기서열 분석법(Next-Generation Sequencing, NGS)은 전 세계적 규모의 전염에 대한 추적감시를 가능하게 하고 바이러스 진화 및 병리학에 대한 통찰력을 이끌어낼 수 있습니다. Illumina System용 Collibri DNA Library Prep Kits를 통한 SARS-CoV-2 게놈 분석은 민감한 변종의 검출과 높은 커버리지를 제공합니다. 신생 변종에 대한 빠르고 민감한 분석을 통해 연구단체는 백신과 치료 개발에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 해당 프로토콜은 모든 Illumina NGS system과 호환 가능합니다.
신종 SARS-CoV-2 변종이 지속적으로 증가함에 따라, 정확하고 정밀하며 빠른 서열분석 전략이 필요합니다. 아래 워크플로우 설명은 ARTIC Network가 처음으로 수립한 amplicon 서열분석 프로토콜을 사용한 코로나 바이러스 연구에 최적화되어 있으며, 해당 프로토콜은 SARS-CoV-2서열분석에 빠르게 적응합니다.
PCR 농축을 이용해 최적화된 SARS-CoV-2 Collibri Next-Generation Sequencing 프로토콜은 총 1,001개의 SARS-CoV-2 양성 임상 샘플의 염기 서열 분석에 사용되었습니다. Figure 1에서 보이는 바와 같이, targeted amplicon 기반의 염기 서열 분석 접근은 비용 효율이 높을 뿐만 아니라, 보다 높은 품질의 결과를 제공합니다. 라이브러리는 Illumina MiSeq system에서 10% v/v Phix sequencing control을 포함하여 2 x 150 bp으로 paired-end 서열분석 방법으로 처리되었습니다. Alignment에는 BWA(bwa mem -t 32 -r 1.0 -k 19 -M -B 6 -v 1)를 사용했습니다. Reference NCBI ASM985889v3 genome에 일치하는 평균 커버리지 또는 평균 리드(read) 개수는 QualiMap BamQC를 통해 계산되었습니다.
Collection 1 | Collection 2 | Collection 3 | Collection 4 | Collection 5 | Collection 6 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
Number of samples | 93 | 192 | 192 | 192 | 140 | 192 |
Mean aligned reads (%) | 97.3 | 70.2 | 85.9 | 85.6 | 91.0 | 86.4 |
Mean aligned reads (counts) | 134,623 | 26,335 | 91,653 | 60,920 | 121,623 | 91,653 |
각 6개 컬렉션 내 커버리지 정도가 다른 샘플의 비중. 총 1,001개의 SARS-CoV-2 양성 임상 샘플을 서열 분석했습니다. 결과에 따르면, Illumina System용 ES DNA Library Prep Kit를 사용하는 amplicon 기반의 워크플로우 솔루션을 통해 대규모 바이러스 추적감시 및 연구가 가능하다는 것을 보여줍니다.
워크플로우
SARS-CoV-2 서열분석에 필요한 재료
Illumina system에서 NGS를 통한 SARS-CoV-2 연구를 진행하기 위해 최적화한 프로토콜은 아래 표에 명시된 시약을 사용합니다.
Table 1. SARS-Cov-2 서열분석에 최적화된 프로토콜의 각 단계에 필요한 시약들은 써모 피셔 사이언티픽이 완벽하게 지원합니다.
| Step | Kit | Catalog numbers |
|---|---|---|
| 1. Purify Total RNA | MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit | A48310, A42352 |
| 2. Reverse transcribe RNA into cDNA | SuperScript IV Reverse Transcriptase and RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor and dNTP Mix (10 mM each) and Random Hexamer Primer | 18090050 and 10777019 and 18427013 and SO142 |
| 3. Enrich PCR | ARTIC v3 primer pools Platinum SuperFi U Multiplex Master Mix | Check the ARTIC Network website for the latest release. A5140024 or A5140096 |
| 4. Prepare NGS libraries | Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systems | Combinatorial Dual indexes (CD) A38605024 (24 preparations), Unique Dual Indexes (UD) A38606024, A43605024, A43606024 and A43607024 (24 preparations) or See Table 3 for more recommendations. |
| 5. Quantify libraries | Collibri Library Quantification Kit or Qubit dsRNA HS Assay Kit | qPCR A38524100, A38524500 or Qubit Q32851, Q32854 |
절차
1단계 : Total RNA 정제
BAL 샘플 용해 후, total RNA를 정제합니다. MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit 는 SARS-CoV-2테스트 처리량을 높이기 위해 최적화되었습니다.
2단계 : RNA를 cDNA로 역전사
최상의 결과를 위해 SuperScript IV Reverse Transcriptase로 first strand cDNA를 합성하고 RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor 를 사용하여 second strand cDNA를 합성합니다.
SuperScript IV Reverse Transcriptase 사용자 가이드
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease 사용자 가이드
3단계 : PCR 농축
Platinum SuperFi U Multiplex Master Mix를 사용한 SARS-CoV-2 서열분석 시 권장 사항을 준수해 주세요.
Platinum SuperFi U Multiplex Master Mix 사용자 가이드
ARTIC Network 웹사이트에서 ARTIC primer pool의 신제품을 확인하세요.
참고 : Thermocycler의 최적의 결합(annealing) 온도를 결정하기 위해 gradient PCR를 수행하는 것을 권장합니다. Thermocycler calibration의 미세한 차이는 특정 amplicon의 누락을 초래할 수 있습니다. 동일한 cDNA input에서 결합(annealing) 온도를 65°C에서 63°C로 낮추어 amplicon을 회복하였습니다.
Illumina System용 Collibri ES DNA Library Prep Kit의 사용자 가이드 중 DNA 샘플 항목의 EDTA 제거방법에 따라 PCR mix cleanup을 진행합니다. 추가 권장 사항은 아래 4단계를 참조하세요.
4단계 : NGS 라이브러리 준비
Illumina System 표준 프로토콜용 Collibri ES DNA Library Prep Kit 에는 아래의 변형사항을 권장합니다.
Collibri ES DNA Library Prep Kits를 사용하는 라이브러리 형성에 권장하는 프로토콜 최적화 조건
| Step | Standard recommendation | PCR mix cleanup | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1. Remove EDTA from DNA samples | (if needed) | PCR mix cleanup according to the Removal of EDTA from DNA samples section of the Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systems user guide | |||||
| Input: 1–500 ng | Input: 50 ng of combined amplicon pool | ||||||
| 2. Fragment the DNA and add dA-tails | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | |||||
| Component | Volume | Component | Volume | ||||
| 10 mM Tris-HCl, ph 7.5-8.5 | to 40 µL | Combined amplicon pools (50 ng) | 40 µL | ||||
| Double-stranded DNA (1 ng - 500 ng) | X µL | 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue) | 5 µL | ||||
| 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue ) | 5 µL | Total volume (light blue mixture) | 45 µL | ||||
| Total volume (light blue mixture ) | 40 µL | ||||||
| Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | ||||||
| Component | Volume | ||||||
| Buffer-DNA mixture from step 1 (light blue mixture) | 40 µL | ||||||
| 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix (clear) | 10 µL | ||||||
| Total volume (light blue mixture) | 50 µL | ||||||
| Recommended fragmentation time and optimization range to attain the desired fragment size | Fragment for 15 minutes at 37℃ Seal the plate and incubate the mixture in a thermal cycler with the heated lid set to 80–85°C, the block pre-cooled to 4°C, and programmed as outlined in the following table: | ||||||
| Fragment size | Fragmentation time at 37°C | Step | Temperature | Time | |||
| Recommen-dation | Recommen-dation | Pre-cool the block | 4ºC | As required | |||
| 150-300 bp | 20 min | 20-30 min | Fragmentation | 37ºC | 15 minutes | ||
| 300-500 bp | 10 min | 10-20 min | dA-tailing | 65ºC | 10 minutes | ||
| 500-700 bp | 5 min | 5-10 min | Hold | 4ºC | Hold | ||
5단계: 라이브러리와 염기서열 정량화
Collibri Library Quantification Kit를 사용하여 최종 서열분석 라이브러리의 농도를 결정합니다. 별도의 변형 과정은 권장하지 않습니다. Illumina의 권장 사항에 따라 flow cell를 투입합니다. 라이브러리는 모든 Illumina NGS system과 호환 가능합니다.
Throughput | Recommendation |
|---|---|
192 preparations per run | For the highest throughput, use A38607096 (CD) with A38607196 (UD). |
120 preparations per run | For mid-throughput, use A38605024 (CD) with A38607196 (UD) together or any UD set of 24 preparations with A38607096 (CD). |
Note: Do not pool together different sizes of kits containing the same type of indexed adaptors (CDs or UDs only). | |
Note: A38606024, A38605024, A43606024, and A43607024 (24 preparations) together are equivalent to A38607196 (96 preparations) and can be ordered interchangeably. | |
아래의 워크플로우 사용 안내는 Illumina NGS system을 사용하여 진행되는 SARS-CoV-2를 포함한 코로나 바이러스 연구에 최적화 되어있습니다. 리투아니아(Lithuania)에 위치한 Santara Clinics Biobank의 승인을 얻어 Bronchoalveolar lavage (BAL) 연구 샘플의 Lysate를 SuperScript IV VILO Master Mix 와 Thermo Scientific Second Strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 정제 후 역전사 처리했습니다. 과정에서 생성된 cDNA는 Illumina Systems용 Collibri ES DNA Library Prep Kit를 사용하여 NGS 라이브러리로 전환되었으며 추가로 농축되었습니다. 라이브러리는 Illumina MiSeq™️ System에서 2 x 150 bp로 서열분석되었습니다.
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| Sample 1 | |
|---|---|
| Sample type | Bronchoalveolar lavage (BAL) |
| Mean coverage (x) | 440.7 |
| Aligned reads (count) | 96,059 |
| Aligned reads (%) | 99.5 |
| SNP calls (count) | 10 |
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| Sample 2 | |
|---|---|
| Sample type | Bronchoalveolar lavage (BAL) |
| Mean coverage (x)612 | 612.1 |
| Aligned reads (count) | 134,431 |
| Aligned reads (%) | 99.6 |
| SNP calls (count) | 12 |
Figure 1. 높은 커버리지와 변종 검출 민감도.코로나 양성 환자로부터 채취한 2개의 연구 샘플로부터 얻은 커버리지는 샘플당 25만개 미만의 리드에서 전체 게놈의 커버리지를 나타냈습니다. 변종 검출 민감도는 개별 샘플에 대한 감식을 분별하는데 적합합니다.
SARS-CoV-2 서열분석에 필요한 재료
Illumina system에서 NGS를 통한 SARS-CoV-2 연구를 진행하기 위해 최적화한 프로토콜은 아래 표에 명시된 시약을 사용합니다.
Table 1. SARS-Cov-2 서열분석에 최적화된 프로토콜의 각 단계에 필요한 시약들은 써모 피셔 사이언티픽이 완벽하게 지원합니다.
| Step | Kit | Catalog numbers |
|---|---|---|
| 1. Purify Total RNA | MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit | A48310, A42352 |
| 2. Reverse transcribe RNA into cDNA | SuperScript IV VILO Master Mix and Second Strand cDNA Synthesis Kit | 11756050, 11756500 and A48570, A48571 |
| 3. Prepare NGS libraries | Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systems | Combinatorial Dual indexes (CD) A38605024, A38607096 Unique Dual Indexes (UD) A38606024, A43605024, A43606024, A43607024, A38607196 |
| 4. Quantify libraries | Collibri Library Quantification Kit or Qubit fluorometric assays | qPCR A38524100, A38524500 or Qubit Q32850, Q32853 |
절차
1단계 : Total RNA 정제
BAL 샘플 용해 후, total RNA를 정제합니다. MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit는 SARS-CoV-2 테스트 처리량을 높이기 위해 최적화되었습니다.
2단계 : RNA를 cDNA로 역전사
최상의 결과를 위해 SuperScript IV Reverse Transcriptase로 first strand cDNA를 합성하고 RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor를 사용하여 second strand cDNA를합성합니다.
SuperScript IV Reverse Transcriptase 사용자 가이드
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease 사용자 가이드
3단계 : PCR 농축
Illumina System 표준 프로토콜용 Collibri ES DNA Library Prep Kit에는 아래의 변형사항을 권장합니다.
Collibri ES DNA Library Prep Kits를 사용하는 라이브러리 형성에 권장하는 프로토콜 최적화 조건
| Step | Standard recommendation | Recommended changes for SARS-CoV-2 samples | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 1. Remove EDTA from DNA samples | (if needed) | Begin with 25 µL after completing reverse transcription | |||
| Input: 1–500 ng | Input: 50 ng | ||||
| 2. Fragment the DNA and add dA-tails | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | |||
| Component | Volume | Component | Volume | ||
| 10 mM Tris-HCl, ph 7.5-8.5 | to 40 µL | cDNA | 10 µL | ||
| Double-stranded DNA (1 ng - 500 ng) | X µL | 10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.5 | to 31 µL | ||
| 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue ) | 5 µL | 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue) | 5 µL | ||
| Total volume (light blue mixture ) | 40 µL | Total volume (light blue mixture) | 36 µL | ||
| Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | ||||
| Component | Volume | Component | Volume | ||
| Buffer-DNA mixture from step 1 (light blue mixture) | 40 µL | Buffer-DNA mixture from step 1 (light blue mixture) | 36 µL | ||
| 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix (clear) | 10 µL | 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix (clear) | 14 µL | ||
| Total volume (light blue mixture) | 50 µL | Total volume (light blue mixture) | 50 µL | ||
| Recommended fragmentation time and optimization range to attain the desired fragment size | Fragment for 20 minutes at 37℃ | ||||
| Fragment size | Fragmentation time at 37°C | ||||
| Recommen-dation | Optimization range | ||||
| 150-300 bp | 20 min | 20-30 min | |||
| 300-500 bp | 10 min | 10-20 min | |||
| 500-700 bp | 5 min | 5-10 min | |||
| 3. Carry out post-ligation double-sided size selection | Double-sided size selection to match target insert size | Customized cleanup protocol | |||
| 4. PCR amplify the library | The number of PCR cycles depends on the starting amount of DNA (i.e., input DNA). | Amplify the library for 12 PCR cycles. | |||
4단계 : SARS-CoV-2를 위한 라이브러리 농축 (권장)
선택 사항인 농축 단계는 코로나바이러스 게놈을 중점으로 두는 프로젝트에 권장합니다. 이 단계는 바이러스성 게놈과 호스트의 상호작용에 대한 연구에서는 생략가능 합니다. 농축 단계 실행 시, 최대 수율을 보장하기 위해 추가적인 증폭(amplification)을 권장합니다.
Table 3. 프로젝트 목표에 따라 선택 사항인 농축(enrichment) 진행 결정
| Research goal | Recommendation | Benefits |
|---|---|---|
| SARS-CoV-2 genomic evolution | Following library prep, enrich for SARS-CoV-2 |
|
| Host-pathogen interactions | No enrichment. Proceed to library quantification |
|
농축한 라이브러리 농축
Collibri 2X library amplification master mix를 사용하여 lid 온도가 105°C로 설정된 thermal cycler에서 PCR를 8회 진행합니다. PCR 완료 후, 증폭(amplification) cleanup 처리합니다 (Illumina System용 Collibri ES DNA Library Prep Kit 매뉴얼 27페이지의 “증폭된 DNA 라이브러리 정제하기”를 참조하세요).
Table 4. 농축된 NGS 라이브러리 증폭을 권장하는 PCR 조건
| Stage | Number of cycles | Temperature | Time |
|---|---|---|---|
| Activate the enzyme | 1 cycle | 98°C | 30 seconds |
| Denature | 3-4 cycles for 100 ng of input DNA 6-8 cycles of 10 ng of input DNA 10-12 cycles for 1 ng of input DNA | 98°C | 15 seconds |
| Anneal | 60°C | 30 seconds | |
| Extend | 72°C | 30 seconds | |
| Final extension | 1 cycle | 72°C | 1 minutes |
| Hold | 1 cycle | 4°C | Hold |
5단계: 라이브러리와 염기서열 정량화
Collibri Library Quantification Kit를사용하여 최종 서열분석 라이브러리의 농도를 결정합니다. 별도의 변형 과정은 권장하지 않습니다. Illumina의 권장 사항에 따라 flow cell를 투입합니다. 라이브러리는 모든 Illumina NGS system과 호환 가능합니다.
신종 SARS-CoV-2 변종이 지속적으로 증가함에 따라, 정확하고 정밀하며 빠른 서열분석 전략이 필요합니다. 아래 워크플로우 설명은 ARTIC Network가 처음으로 수립한 amplicon 서열분석 프로토콜을 사용한 코로나 바이러스 연구에 최적화되어 있으며, 해당 프로토콜은 SARS-CoV-2서열분석에 빠르게 적응합니다.
PCR 농축을 이용해 최적화된 SARS-CoV-2 Collibri Next-Generation Sequencing 프로토콜은 총 1,001개의 SARS-CoV-2 양성 임상 샘플의 염기 서열 분석에 사용되었습니다. Figure 1에서 보이는 바와 같이, targeted amplicon 기반의 염기 서열 분석 접근은 비용 효율이 높을 뿐만 아니라, 보다 높은 품질의 결과를 제공합니다. 라이브러리는 Illumina MiSeq system에서 10% v/v Phix sequencing control을 포함하여 2 x 150 bp으로 paired-end 서열분석 방법으로 처리되었습니다. Alignment에는 BWA(bwa mem -t 32 -r 1.0 -k 19 -M -B 6 -v 1)를 사용했습니다. Reference NCBI ASM985889v3 genome에 일치하는 평균 커버리지 또는 평균 리드(read) 개수는 QualiMap BamQC를 통해 계산되었습니다.
Collection 1 | Collection 2 | Collection 3 | Collection 4 | Collection 5 | Collection 6 | |
|---|---|---|---|---|---|---|
Number of samples | 93 | 192 | 192 | 192 | 140 | 192 |
Mean aligned reads (%) | 97.3 | 70.2 | 85.9 | 85.6 | 91.0 | 86.4 |
Mean aligned reads (counts) | 134,623 | 26,335 | 91,653 | 60,920 | 121,623 | 91,653 |
각 6개 컬렉션 내 커버리지 정도가 다른 샘플의 비중. 총 1,001개의 SARS-CoV-2 양성 임상 샘플을 서열 분석했습니다. 결과에 따르면, Illumina System용 ES DNA Library Prep Kit를 사용하는 amplicon 기반의 워크플로우 솔루션을 통해 대규모 바이러스 추적감시 및 연구가 가능하다는 것을 보여줍니다.
워크플로우
SARS-CoV-2 서열분석에 필요한 재료
Illumina system에서 NGS를 통한 SARS-CoV-2 연구를 진행하기 위해 최적화한 프로토콜은 아래 표에 명시된 시약을 사용합니다.
Table 1. SARS-Cov-2 서열분석에 최적화된 프로토콜의 각 단계에 필요한 시약들은 써모 피셔 사이언티픽이 완벽하게 지원합니다.
| Step | Kit | Catalog numbers |
|---|---|---|
| 1. Purify Total RNA | MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit | A48310, A42352 |
| 2. Reverse transcribe RNA into cDNA | SuperScript IV Reverse Transcriptase and RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor and dNTP Mix (10 mM each) and Random Hexamer Primer | 18090050 and 10777019 and 18427013 and SO142 |
| 3. Enrich PCR | ARTIC v3 primer pools Platinum SuperFi U Multiplex Master Mix | Check the ARTIC Network website for the latest release. A5140024 or A5140096 |
| 4. Prepare NGS libraries | Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systems | Combinatorial Dual indexes (CD) A38605024 (24 preparations), Unique Dual Indexes (UD) A38606024, A43605024, A43606024 and A43607024 (24 preparations) or See Table 3 for more recommendations. |
| 5. Quantify libraries | Collibri Library Quantification Kit or Qubit dsRNA HS Assay Kit | qPCR A38524100, A38524500 or Qubit Q32851, Q32854 |
절차
1단계 : Total RNA 정제
BAL 샘플 용해 후, total RNA를 정제합니다. MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit 는 SARS-CoV-2테스트 처리량을 높이기 위해 최적화되었습니다.
2단계 : RNA를 cDNA로 역전사
최상의 결과를 위해 SuperScript IV Reverse Transcriptase로 first strand cDNA를 합성하고 RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor 를 사용하여 second strand cDNA를 합성합니다.
SuperScript IV Reverse Transcriptase 사용자 가이드
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease 사용자 가이드
3단계 : PCR 농축
Platinum SuperFi U Multiplex Master Mix를 사용한 SARS-CoV-2 서열분석 시 권장 사항을 준수해 주세요.
Platinum SuperFi U Multiplex Master Mix 사용자 가이드
ARTIC Network 웹사이트에서 ARTIC primer pool의 신제품을 확인하세요.
참고 : Thermocycler의 최적의 결합(annealing) 온도를 결정하기 위해 gradient PCR를 수행하는 것을 권장합니다. Thermocycler calibration의 미세한 차이는 특정 amplicon의 누락을 초래할 수 있습니다. 동일한 cDNA input에서 결합(annealing) 온도를 65°C에서 63°C로 낮추어 amplicon을 회복하였습니다.
Illumina System용 Collibri ES DNA Library Prep Kit의 사용자 가이드 중 DNA 샘플 항목의 EDTA 제거방법에 따라 PCR mix cleanup을 진행합니다. 추가 권장 사항은 아래 4단계를 참조하세요.
4단계 : NGS 라이브러리 준비
Illumina System 표준 프로토콜용 Collibri ES DNA Library Prep Kit 에는 아래의 변형사항을 권장합니다.
Collibri ES DNA Library Prep Kits를 사용하는 라이브러리 형성에 권장하는 프로토콜 최적화 조건
| Step | Standard recommendation | PCR mix cleanup | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 1. Remove EDTA from DNA samples | (if needed) | PCR mix cleanup according to the Removal of EDTA from DNA samples section of the Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systems user guide | |||||
| Input: 1–500 ng | Input: 50 ng of combined amplicon pool | ||||||
| 2. Fragment the DNA and add dA-tails | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | |||||
| Component | Volume | Component | Volume | ||||
| 10 mM Tris-HCl, ph 7.5-8.5 | to 40 µL | Combined amplicon pools (50 ng) | 40 µL | ||||
| Double-stranded DNA (1 ng - 500 ng) | X µL | 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue) | 5 µL | ||||
| 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue ) | 5 µL | Total volume (light blue mixture) | 45 µL | ||||
| Total volume (light blue mixture ) | 40 µL | ||||||
| Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | ||||||
| Component | Volume | ||||||
| Buffer-DNA mixture from step 1 (light blue mixture) | 40 µL | ||||||
| 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix (clear) | 10 µL | ||||||
| Total volume (light blue mixture) | 50 µL | ||||||
| Recommended fragmentation time and optimization range to attain the desired fragment size | Fragment for 15 minutes at 37℃ Seal the plate and incubate the mixture in a thermal cycler with the heated lid set to 80–85°C, the block pre-cooled to 4°C, and programmed as outlined in the following table: | ||||||
| Fragment size | Fragmentation time at 37°C | Step | Temperature | Time | |||
| Recommen-dation | Recommen-dation | Pre-cool the block | 4ºC | As required | |||
| 150-300 bp | 20 min | 20-30 min | Fragmentation | 37ºC | 15 minutes | ||
| 300-500 bp | 10 min | 10-20 min | dA-tailing | 65ºC | 10 minutes | ||
| 500-700 bp | 5 min | 5-10 min | Hold | 4ºC | Hold | ||
5단계: 라이브러리와 염기서열 정량화
Collibri Library Quantification Kit를 사용하여 최종 서열분석 라이브러리의 농도를 결정합니다. 별도의 변형 과정은 권장하지 않습니다. Illumina의 권장 사항에 따라 flow cell를 투입합니다. 라이브러리는 모든 Illumina NGS system과 호환 가능합니다.
Throughput | Recommendation |
|---|---|
192 preparations per run | For the highest throughput, use A38607096 (CD) with A38607196 (UD). |
120 preparations per run | For mid-throughput, use A38605024 (CD) with A38607196 (UD) together or any UD set of 24 preparations with A38607096 (CD). |
Note: Do not pool together different sizes of kits containing the same type of indexed adaptors (CDs or UDs only). | |
Note: A38606024, A38605024, A43606024, and A43607024 (24 preparations) together are equivalent to A38607196 (96 preparations) and can be ordered interchangeably. | |
아래의 워크플로우 사용 안내는 Illumina NGS system을 사용하여 진행되는 SARS-CoV-2를 포함한 코로나 바이러스 연구에 최적화 되어있습니다. 리투아니아(Lithuania)에 위치한 Santara Clinics Biobank의 승인을 얻어 Bronchoalveolar lavage (BAL) 연구 샘플의 Lysate를 SuperScript IV VILO Master Mix 와 Thermo Scientific Second Strand cDNA Synthesis Kit를 사용하여 정제 후 역전사 처리했습니다. 과정에서 생성된 cDNA는 Illumina Systems용 Collibri ES DNA Library Prep Kit를 사용하여 NGS 라이브러리로 전환되었으며 추가로 농축되었습니다. 라이브러리는 Illumina MiSeq™️ System에서 2 x 150 bp로 서열분석되었습니다.
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| Sample 1 | |
|---|---|
| Sample type | Bronchoalveolar lavage (BAL) |
| Mean coverage (x) | 440.7 |
| Aligned reads (count) | 96,059 |
| Aligned reads (%) | 99.5 |
| SNP calls (count) | 10 |
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| Sample 2 | |
|---|---|
| Sample type | Bronchoalveolar lavage (BAL) |
| Mean coverage (x)612 | 612.1 |
| Aligned reads (count) | 134,431 |
| Aligned reads (%) | 99.6 |
| SNP calls (count) | 12 |
Figure 1. 높은 커버리지와 변종 검출 민감도.코로나 양성 환자로부터 채취한 2개의 연구 샘플로부터 얻은 커버리지는 샘플당 25만개 미만의 리드에서 전체 게놈의 커버리지를 나타냈습니다. 변종 검출 민감도는 개별 샘플에 대한 감식을 분별하는데 적합합니다.
SARS-CoV-2 서열분석에 필요한 재료
Illumina system에서 NGS를 통한 SARS-CoV-2 연구를 진행하기 위해 최적화한 프로토콜은 아래 표에 명시된 시약을 사용합니다.
Table 1. SARS-Cov-2 서열분석에 최적화된 프로토콜의 각 단계에 필요한 시약들은 써모 피셔 사이언티픽이 완벽하게 지원합니다.
| Step | Kit | Catalog numbers |
|---|---|---|
| 1. Purify Total RNA | MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit | A48310, A42352 |
| 2. Reverse transcribe RNA into cDNA | SuperScript IV VILO Master Mix and Second Strand cDNA Synthesis Kit | 11756050, 11756500 and A48570, A48571 |
| 3. Prepare NGS libraries | Collibri ES DNA Library Prep Kit for Illumina Systems | Combinatorial Dual indexes (CD) A38605024, A38607096 Unique Dual Indexes (UD) A38606024, A43605024, A43606024, A43607024, A38607196 |
| 4. Quantify libraries | Collibri Library Quantification Kit or Qubit fluorometric assays | qPCR A38524100, A38524500 or Qubit Q32850, Q32853 |
절차
1단계 : Total RNA 정제
BAL 샘플 용해 후, total RNA를 정제합니다. MagMAX Viral/Pathogen Nucleic Acid Isolation Kit는 SARS-CoV-2 테스트 처리량을 높이기 위해 최적화되었습니다.
2단계 : RNA를 cDNA로 역전사
최상의 결과를 위해 SuperScript IV Reverse Transcriptase로 first strand cDNA를 합성하고 RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor를 사용하여 second strand cDNA를합성합니다.
SuperScript IV Reverse Transcriptase 사용자 가이드
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease 사용자 가이드
3단계 : PCR 농축
Illumina System 표준 프로토콜용 Collibri ES DNA Library Prep Kit에는 아래의 변형사항을 권장합니다.
Collibri ES DNA Library Prep Kits를 사용하는 라이브러리 형성에 권장하는 프로토콜 최적화 조건
| Step | Standard recommendation | Recommended changes for SARS-CoV-2 samples | |||
|---|---|---|---|---|---|
| 1. Remove EDTA from DNA samples | (if needed) | Begin with 25 µL after completing reverse transcription | |||
| Input: 1–500 ng | Input: 50 ng | ||||
| 2. Fragment the DNA and add dA-tails | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | On ice or a cooling rack, assemble the fragmentation and dA-tailing reaction for each DNA sample in a sterile 0.2-mL thin-wall PCR tube. Add the reagents in the order given. | |||
| Component | Volume | Component | Volume | ||
| 10 mM Tris-HCl, ph 7.5-8.5 | to 40 µL | cDNA | 10 µL | ||
| Double-stranded DNA (1 ng - 500 ng) | X µL | 10 mM Tris-HCl, pH 7.5-8.5 | to 31 µL | ||
| 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue ) | 5 µL | 10X Fragmentation and dA-tailing Buffer (blue) | 5 µL | ||
| Total volume (light blue mixture ) | 40 µL | Total volume (light blue mixture) | 36 µL | ||
| Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | Add 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix to the sample. | ||||
| Component | Volume | Component | Volume | ||
| Buffer-DNA mixture from step 1 (light blue mixture) | 40 µL | Buffer-DNA mixture from step 1 (light blue mixture) | 36 µL | ||
| 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix (clear) | 10 µL | 5X Fragmentation and dA-tailing Enzyme Mix (clear) | 14 µL | ||
| Total volume (light blue mixture) | 50 µL | Total volume (light blue mixture) | 50 µL | ||
| Recommended fragmentation time and optimization range to attain the desired fragment size | Fragment for 20 minutes at 37℃ | ||||
| Fragment size | Fragmentation time at 37°C | ||||
| Recommen-dation | Optimization range | ||||
| 150-300 bp | 20 min | 20-30 min | |||
| 300-500 bp | 10 min | 10-20 min | |||
| 500-700 bp | 5 min | 5-10 min | |||
| 3. Carry out post-ligation double-sided size selection | Double-sided size selection to match target insert size | Customized cleanup protocol | |||
| 4. PCR amplify the library | The number of PCR cycles depends on the starting amount of DNA (i.e., input DNA). | Amplify the library for 12 PCR cycles. | |||
4단계 : SARS-CoV-2를 위한 라이브러리 농축 (권장)
선택 사항인 농축 단계는 코로나바이러스 게놈을 중점으로 두는 프로젝트에 권장합니다. 이 단계는 바이러스성 게놈과 호스트의 상호작용에 대한 연구에서는 생략가능 합니다. 농축 단계 실행 시, 최대 수율을 보장하기 위해 추가적인 증폭(amplification)을 권장합니다.
Table 3. 프로젝트 목표에 따라 선택 사항인 농축(enrichment) 진행 결정
| Research goal | Recommendation | Benefits |
|---|---|---|
| SARS-CoV-2 genomic evolution | Following library prep, enrich for SARS-CoV-2 |
|
| Host-pathogen interactions | No enrichment. Proceed to library quantification |
|
농축한 라이브러리 농축
Collibri 2X library amplification master mix를 사용하여 lid 온도가 105°C로 설정된 thermal cycler에서 PCR를 8회 진행합니다. PCR 완료 후, 증폭(amplification) cleanup 처리합니다 (Illumina System용 Collibri ES DNA Library Prep Kit 매뉴얼 27페이지의 “증폭된 DNA 라이브러리 정제하기”를 참조하세요).
Table 4. 농축된 NGS 라이브러리 증폭을 권장하는 PCR 조건
| Stage | Number of cycles | Temperature | Time |
|---|---|---|---|
| Activate the enzyme | 1 cycle | 98°C | 30 seconds |
| Denature | 3-4 cycles for 100 ng of input DNA 6-8 cycles of 10 ng of input DNA 10-12 cycles for 1 ng of input DNA | 98°C | 15 seconds |
| Anneal | 60°C | 30 seconds | |
| Extend | 72°C | 30 seconds | |
| Final extension | 1 cycle | 72°C | 1 minutes |
| Hold | 1 cycle | 4°C | Hold |
5단계: 라이브러리와 염기서열 정량화
Collibri Library Quantification Kit를사용하여 최종 서열분석 라이브러리의 농도를 결정합니다. 별도의 변형 과정은 권장하지 않습니다. Illumina의 권장 사항에 따라 flow cell를 투입합니다. 라이브러리는 모든 Illumina NGS system과 호환 가능합니다.
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