Aplicaciones del espectrofotómetro de microvolumen NanoDrop

Las bibliotecas de referencia Acclaro actualmente admiten la detección de proteínas, fenol, HCl de guanidina y ARN en muestras de dsADN. También admiten la detección de proteínas, fenol, isotiocianato de guanidina y dsADN en muestras de ARN. Finalmente, permiten la detección de ADN en muestras de proteínas. En el futuro se añadirán más contaminantes en las bibliotecas.

La identificación de contaminantes proporciona a los investigadores dos datos importantes. En primer lugar, permite identificar contaminantes específicos que probablemente estén presentes en la muestra. Esta información puede ayudar a los científicos a solucionar problemas de extracciones o purificaciones difíciles y a tomar decisiones con respecto al uso de muestras en experimentos posteriores. En segundo lugar, proporciona una concentración corregida del analito. Al establecer reacciones posteriores, como PCR, donde la concentración de ADN es un parámetro esencial, la concentración corregida ayudará a los científicos a garantizar el éxito de los experimentos posteriores.

Por ejemplo, la contaminación por ARN en preparaciones de ADN genómico es un problema común en los flujos de trabajo de biología molecular. En la espectrofotometría tradicional, la presencia de ARN copurificado puede inflar artificialmente la concentración de ADN. Al utilizar los datos espectrales completos y los algoritmos matemáticos multivariantes disponibles en el software Acclaro, los investigadores pueden identificar la contaminación por ARN en una muestra de ADN y ver los resultados de concentración de ADN corregidos.

Las guías MIQE (información mínima para la publicación de experimentos de PCR cuantitativos en tiempo real)requieren que la cantidad y la pureza del ARN de entrada se notifiquen en publicaciones que utilizan la qPCR.

Las muestras de proteínas purificadas se pueden medir con precisión utilizando la absorbancia directa a 280 nm, que se debe principalmente a las cadenas aromáticas de los aminoácidos Trp y Tyr. Protein A280, una aplicación preconfigurada en nuestro software, es el método de cuantificación más popular porque es rápido y sencillo, no requiere reactivos ni curvas estándar y consume muy poca muestra.

A diferencia de los ácidos nucleicos, cada proteína pura tiene un coeficiente de extinción Beer-Lambert único basado en su secuencia de aminoácidos. Para obtener resultados precisos, seleccione el tipo de muestra correcto en el menú o introduzca su coeficiente de extinción de proteínas de forma manual. La función de edición de proteínas de NanoDrop One y NanoDrop Eight le permite guardar los coeficientes de extinción de proteínas concretas para que pueda personalizar las opciones de tipo de muestra.

Además de la concentración, los espectrofotómetros NanoDrop pueden proporcionar información sobre los contaminantes de la muestra. La tecnología inteligente de análisis de muestras Acclaro (incluida en los instrumentos NanoDrop One/One^C y NanoDrop Eight) utiliza algoritmos matemáticos para detectar ácidos nucleicos en muestras de proteínas y corregir el resultado de la concentración según sea necesario. La pureza de la muestra también se puede evaluar midiendo su relación A260/A280; un valor >1 puede indicar la contaminación del ácido nucleico en la muestra de proteínas.

¿Qué sucede si su proteína o péptido carece de residuos de Trp y Tyr y, por lo tanto, no se puede medir con la aplicación A280? Dado que el esqueleto peptídico de una proteína absorbe la luz a 190-220 nm, los péptidos que no tienen residuos de Tyr o Trp se pueden cuantificar utilizando la absorbancia a 205 nm. Protein A205 es una aplicación preconfigurada en el software NanoDrop.

Las proteínas que tienen cantidades significativas de Trp y Tyr también se pueden cuantificar mediante la aplicación A205, seleccionando la opción del método Scopes. De hecho, el método A205 tiene algunas ventajas respecto al método de proteínas A280, como una menor variabilidad entre proteínas (porque los coeficientes de extinción A205 no se basan en la composición de aminoácidos) y una mayor sensibilidad (debido a la alta absorbancia molar de las proteínas a 205 nm). Aunque las limitaciones técnicas dificultaron estas mediciones en el pasado, la tecnología de retención de muestras NanoDrop y el bajo rendimiento de la luz parásita han simplificado la cuantificación de pequeñas cantidades de proteínas mediante métodos A205.

Una limitación del método A205 es que muchos tampones de proteínas utilizados habitualmente tienen absorbancia a 205 nm. Antes de utilizar esta técnica, se recomienda comprobar si el tampón de proteínas contribuye a la absorbancia a 205 nm.

Las proteínas de mezclas complejas, como los extractos celulares o los lisados, se miden mejor mediante un ensayo colorimétrico de proteínas, como los ensayos Bradford, BCA, Lowry o Pierce a 660 nm. Estos ensayos proporcionan concentraciones específicas de proteínas, lo que evita la absorbancia de componentes celulares que absorben en el rango de UV e inflan A280. Estas y otras aplicaciones están preconfiguradas en algunos instrumentos NanoDrop.

Los anticuerpos etiquetados u otras proteínas y metaloproteínas etiquetadas con fluorescencia se pueden cuantificar mediante la aplicación de software preconfigurada Proteins & Labels , que proporciona la proteína, así como la concentración de la etiqueta (hasta dos colorantes). Esta aplicación está disponible como aplicación preconfigurada en los espectrofotómetros NanoDrop One/One^C y NanoDrop Eight.

Como ejemplo de caso, en la producción de vacunas de ARNm —tan esencial en la batalla contra el SARS-CoV-2 y cada vez más utilizada contra otros virus—, los controles de calidad de la concentración y pureza de las muestras son útiles en varios pasos del proceso.

• En la fase de secuenciación , tanto la calidad como la cantidad del material inicial son cruciales para obtener resultados precisos.
• En la producción de plásmidos, se debe comprobar el plasma purificado en busca de ADN genómico y otros contaminantes.
• En la transcripción in vitro, se debe comprobar la pureza del ARNm purificado antes de que la solución de ARNm se llene en los viales de la vacuna.

En nuestro seminario web con previa solicitud podrá ver cómo los espectrofotómetros NanoDrop One/One^C y NanoDrop Eight pueden utilizarse fácilmente para todas estas tareas. Y, con el software disponible para ayudar a cumplir con la normativa de la FDA 21 CFR parte 11, estos instrumentos están listos para implantarse en la rutina de trabajo de las vacunas de ARNm de un laboratorio GMP.

Nuestros prestigiosos y fiables espectrofotómetros NanoDrop One/One^C y NanoDrop Eight se pueden utilizar en entornos sujetos a regulación, como el farmacéutico y el biotecnológico. Estos modelos pueden ayudarle a cuantificar y calificar muestras de ADN, ARN y proteínas de solo 1-2 µL en pocos segundos y obtener datos de espectro completo para confirmar que las muestras son aptas para aplicaciones posteriores.

Además, el software opcional Thermo Scientific Security Suite o Thermo Scientific SciVault ayuda a su laboratorio a cumplir la normativa sobre datos de la FDA estadounidense en cada paso del proceso. Estos módulos de software permiten el cumplimiento normativo de la parte 11 del título 21 del Código de Reglamentos Federales de la FDA de EE.UU. relativo a los registros y firmas electrónicas (21 CFR parte 11).

La tabla muestra las características seleccionadas del software Security Suite para el espectrofotómetro NanoDrop One/One^C , que incluyen acceso a cuentas de usuario, capacidad de seguimiento de auditoría, firmas electrónicas, copia de seguridad de datos automatizada y mucho más. El software SciVault para el instrumento NanoDrop Eight ofrece una funcionalidad similar.

El entorno normativo siempre cambiante al que se enfrentan los fabricantes de productos farmacéuticos y otros sectores sujetos a regulación puede causar confusión y dudas sobre el cumplimiento. Los sistemas de instrumentos diseñados para cumplir los requisitos normativos pueden aligerar la carga de los fabricantes. ¿Cómo lo hacen? Vea a nuestro seminario web sobre el cumplimiento de la garantía de calidad/control de calidad en los laboratorios farmacéuticos para ver cómo dos plataformas de instrumentos diferentes —el espectrómetro Thermo Scientific Nicolet Summit FTIR (para la garantía de calidad/control de calidad de la materia prima y terminada) y el espectrofotómetro NanoDrop One (para cuantificación de ADN, ARN y proteínas)— ayudan a los laboratorios a garantizar el cumplimiento de sus procesos.

El crecimiento de cultivos bacterianos se puede controlar midiendo su densidad óptica a 600 nm (OD₆₀₀). Aunque se trata de una técnica esencial en microbiología, estas mediciones de la densidad óptica suelen contener muy poca absorbancia química real. En su lugar, son representativas de la cantidad de luz que la suspensión bacteriana dispersa lejos del detector del instrumento.

Puede medir la OD₆₀₀ en los espectrofotómetros NanoDrop One/One^C y NanoDrop Eight mediante la aplicación preprogramada OD600 . El software utiliza la ecuación de Beer-Lambert y un factor de conversión del número de células introducido por el usuario para convertir automáticamente el valor de la OD₆₀₀ en el número de células por mililitro.

Tenga en cuenta que en el instrumento NanoDrop One^C , las opciones de pedestal y cubeta darán diferentes valores de OD₆₀₀ . Puede utilizar un factor de conversión para comparar las mediciones de pedestal y cubeta.

Con el instrumento NanoDrop One^C puede realizar mediciones cinéticas basadas en el tiempo en muestras en cubetas. Puede designar hasta tres longitudes de onda de 190 a 850 nm para la supervisión continua de la absorbancia a intervalos definidos por el usuario en un máximo de 5 etapas. Las mediciones de cubeta ofrecen un límite de detección más bajo y un calentador y un microragitador de 37 °C opcionales.

Puede crear, editar y guardar experimentos de cinética como métodos personalizados.

Los espectrofotómetros NanoDrop incluyen métodos precargados para la cuantificación de ácidos nucleicos (como dsADN, ssADN y ARN) y la cuantificación de proteínas (como A280, BCA y Bradford), como se describe en las secciones anteriores. También puede crear métodos personalizados en el espectrofotómetro NanoDrop One/One^C o NanoDrop Eight para realizar UV-Vis u otras mediciones definidas por el usuario que se adapten a sus necesidades, lo que permite que el instrumento funcione como un espectrofotómetro convencional. Los métodos personalizados pueden monitorizar y notificar hasta 40 longitudes de onda de 190 a 850 nm, y se pueden configurar directamente desde la pantalla táctil o el software de control de PC. Los métodos personalizados proporcionan la flexibilidad necesaria para utilizar su instrumento para otras aplicaciones.

• Utilice el método personalizado predefinido para analizar muestras como nanopartículas, clorofila, hemoglobina, glucosa y proteínas mediante ensayos BCA.
• Cree nuevos métodos personalizados para analizar sus muestras especiales y guardar los métodos para su uso futuro.

Como ejemplo de caso, se puede utilizar un espectrofotómetro para cuantificar diversas formas de hemoglobina utilizando el coeficiente de extinción adecuado y el valor de absorbancia de picos.

• La oxihemoglobina contiene oxígeno unido y muestra picos de absorbancia a 414 nm, 541 nm y 576 nm.
• La desoxihemoglobina no contiene oxígeno unido y muestra un pico de absorbancia a 431 nm.
• La metahemoglobina no puede unirse al oxígeno porque contiene hierro en estado férrico y presenta un pico de absorbancia a 406 nm.

Hemos creado un método personalizado para el instrumento NanoDrop One/One^C que permite medir la absorbancia de la hemoglobina a 406, 414, 431, 541 y 576 nm, las cinco longitudes de onda necesarias para diferenciar la oxihemoglobina, la desoxihemoglobina y la metahemoglobina. Este gráfico de resultados muestra un espectro de absorbancia típico para la metahemoglobina.

La quimiometría es el uso de modelos matemáticos multivariantes y técnicas estadísticas para determinar la información cuantitativa de la concentración de muchos componentes simultáneamente. Cuando se utilizan para analizar los datos de UV-Vis de muestras químicas complejas (mezclas), la quimiometría puede proporcionar un método eficaz para determinar la concentración de especies químicas que tienen espectros superpuestos. Históricamente, la sofisticación de sus modelos de calibración multivariante limitaba su uso a quienes poseían un profundo conocimiento del campo, por lo que la mayoría de los datos tenían que transmitirse a un experto en quimiometría para el análisis posterior a la recogida.

El software Thermo Scientific NanoDrop QC proporciona un potente análisis quimiométrico a la plataforma de medición de microvolumen NanoDrop One^C . Esta combinación es una solución atractiva para una gran variedad de aplicaciones, como los análisis petroquímicos, de pureza de fármacos, la fabricación de polímeros, las aplicaciones de colorantes alimentarios y muchas más aplicaciones en las que se requiere un análisis quimiométrico.

El software NanoDrop QC simplifica y agiliza el desarrollo e implementación de métodos quimiométricos. Los científicos que desarrollan métodos pueden recoger espectros sobre los compuestos de su elección e importarlos en el software Thermo Scientific TQ Analyst para construir el método. Los métodos se pueden implementar directamente en los espectrofotómetros NanoDrop One^C UV-Vis en todo el mundo, lo que permite a los técnicos de control de calidad obtener resultados de aprobado/no aprobado y otros resultados cuantitativos en la fábrica.

La tecnología UV-Vis basada en cubetas y el software quimiométrico basado en PC son elementos básicos en el análisis de calidad de líquidos como colorantes, lubricantes y adhesivos. La preparación de muestras y el análisis de estas soluciones pueden incluir varios procesos que requieren mucho tiempo y que repercuten en la comercialización de productos de alto valor. Nuestro innovador espectrofotómetro UV-Vis de rango automático elimina pasos que requieren mucho tiempo, como la dilución de muestras altamente concentradas, y simplifica el análisis de datos de desarrollo de métodos quimiométricos.

En nuestra nota de aplicación de quimiometría, mostramos un planteamiento paso a paso para crear y validar un método quimiométrico que determina las concentraciones de colorantes azoicos individuales en una mezcla compleja. Mostramos cómo se puede utilizar el software NanoDrop QC para obtener información cuantitativa en muestras que tienen varios componentes con espectros UV-Vis muy superpuestos.

El acceso a la instrumentación del mundo real es clave para preparar e inspirar a la próxima generación de científicos. La experiencia práctica ayuda a hacer que la ciencia sea más accesible y que los principios científicos sean más memorables.

En particular, la espectroscopía UV-Vis es una herramienta valiosa para el estudio de macromoléculas como proteínas y ácidos nucleicos en el aula de biología. La simplicidad y la asequibilidad de los instrumentos NanoDrop los hace muy adecuados para su uso en los programas de estudios universitarios, e incluso en las clases ciencias en secundaria. La experiencia con los espectrofotómetros NanoDrop puede servir de apoyo para las clases de genómica, inmunología, crecimiento de células microbianas, cinética enzimática y la estructura y función de los componentes fundamentales de la vida.

Este seminario web documenta cómo dos profesores de secundaria han integrado los espectrofotómetros NanoDrop One en sus clases y talleres.